斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明涉及水产动物免疫学，具体涉及一种具有免疫保护性的斑点叉尾鮰小rna病毒亚单位疫苗、及其制备方法和应用。

背景技术：

1、斑点叉尾鮰又称沟鲶，是鮰科、真鮰属鱼类，属大型鱼类原产于美国。八十年代中期由湖北省水产研究所率先引进，随后在全国被广泛养殖，现已成为发展外向型渔业的重要养殖品种。近年来，随着养殖规模的不断扩大和养殖密度的不断提高，斑点叉尾鮰病害频发，且病症有愈发复杂的趋势，给广大养殖户造成了巨大的经济损失，以前斑点叉尾鮰的病害研究大多集中在细菌、真菌和寄生虫等病原，对病毒性的研究甚少。

2、2020年江苏、湖北、浙江等养殖区内斑点叉尾鮰连续爆发出急性且高致死率的出血病，患病表现症状为鱼体表颜色加深、出血；肝脏、脾脏和肾脏坏死或出血等症状。该病传播迅猛，抗生素治疗无效，针对这一现象，申请人从江苏、湖北两地进行采样，通过高通量测序方法对具有明显病症的斑点叉尾鮰样本的肾脏、脾脏、肾脏组织进行测序分析，组织切片观察、细菌培养筛查、人工感染实验等实验，最终鉴定出该致病性病原为单链rna病毒，目前关于该病毒的研究甚少。

技术实现思路

1、通过对该单链rna病毒研究，制备得到了该小rna病毒的疫苗，其抗原序列为如seqid no:1所示的多肽。

2、该抗原序列是通过高通量测序、宏基因组测序、蛋白质组鉴定、netctl、wapp及bepipred1.0 serever软件进行蛋白质结构和功能分析所得，免疫斑点叉尾鮰后感染试验验证，其可以有效的保护斑点叉尾鮰免受斑点叉尾鮰小rna病毒的伤害，并且保护率能达到85％以上。

3、本发明的目的之二在于保护编码上述斑点叉尾鮰小rna病毒亚单位疫苗抗原的核苷酸序列。其中，优选的，该核苷酸序列如seq id no:2所示。

4、本发明的目的之三在于保护含有上述核苷酸序列的生物材料，所述生物材料包括重组dna、重组质粒、工程菌。

5、本发明的目的之四在于保护上述斑点叉尾鮰小rna病毒亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：扩增能够编码斑点叉尾鮰小rna病毒亚单位疫苗抗原的核苷酸序列，构建重组表达质粒，并转化到大肠杆菌细胞中进行诱导表达，分离纯化后即得。

6、优选的，重组表达质粒先转化到大肠杆菌dh5α感受态后再进行提取，提取后再转入到大肠杆菌bl21(de3)中，进行诱导表达。

7、优选的，构建重组表达质粒时所用的质粒为pet32a。

8、本发明的目的之五在于保护上述疫苗、核苷酸序列在制备保护斑点叉尾鮰免受斑点叉尾鮰小rna病毒伤害的制剂中的应用。

9、本发明的目的之六在于保护上述疫苗、核苷酸序列在保护斑点叉尾鮰免受斑点叉尾鮰小rna病毒伤害中的应用。

10、本发明以斑点叉尾鮰小rna病毒衣壳蛋白上的一段序列作为抗原制备得到亚单位疫苗，其抗原是中和性抗原蛋白，不是灭活或者减毒疫苗，能够有效的保护斑点叉尾鮰免受该病毒的伤害，且保护率能达到85％。该疫苗与其他疫苗(如活载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗等)相比，不含病毒成分，生产和使用过程不会存在病毒抗原丢失、抗原结构被破坏的问题，无传染病毒可能性，也不会存在核酸dna可能诱导产生自身免疫反应，导致机体对抗原产生免疫耐受性的问题，并且该疫苗免疫特异性强、重复性好、成本低且安全；该疫苗目前已经被成功用于斑点叉尾鮰的养殖中。

技术特征：

1.一种斑点叉尾鮰小rna病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原是序列如seqid no:1所示的多肽。

2.编码斑点叉尾鮰小rna病毒亚单位疫苗抗原的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的编码斑点叉尾鮰小rna病毒亚单位疫苗抗原的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如seq id no:2所示。

4.含有权利要求2或3所述的核苷酸序列的生物材料，所述生物材料包括重组dna、重组质粒、工程菌。

5.权利要求1所述的斑点叉尾鮰小rna病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的斑点叉尾鮰小rna病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，重组表达质粒先转化到大肠杆菌dh5α感受态后再进行提取，提取后再转入到大肠杆菌bl21中，进行诱导表达。

7.根据权利要求5所述的斑点叉尾鮰小rna病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，构建重组表达质粒时所用的质粒为pet32a。

8.权利要求1所述的斑点叉尾鮰小rna病毒亚单位疫苗、权利要求2或3所述的核苷酸序列在制备保护斑点叉尾鮰免受小rna病毒伤害的制剂中的应用。

9.权利要求1所述的斑点叉尾鮰小rna病毒亚单位疫苗、权利要求2或3所述的核苷酸序列在保护斑点叉尾鮰免受斑点叉尾鮰小rna病毒伤害中的应用。

技术总结
本发明涉及水产动物免疫学，具体涉及一种具有免疫保护性的斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗、及其制备方法和应用。该疫苗的抗原序列是如SEQ ID NO:1所示的多肽，其可以通过构建表达载体、转化到大肠杆菌中进行诱导表达并分离纯化得到，其对斑点叉尾鮰的保护率超过85％，已经作为一种疫苗和药物用于斑点叉尾鮰的养殖中。

技术研发人员：张莉,柳芹
受保护的技术使用者：武汉华扬天乐生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12