腺相关病毒(AAV)的生产的制作方法

本公开涉及用于在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法。

背景技术：

1、腺相关病毒(aav)是一种无包膜dna病毒。作为体内基因治疗的主要病毒载体，aav是非致病性的并可以有效地感染大范围人体组织。aav基因组包含一个4.7kb的单链dna，该单链dna编码两个主要基因：rep基因编码四种亚型(rep78、rep68、rep52和rep40)，其支持aav dna复制、包装、整合和转录；cap基因合成三种用于病毒蛋白壳或衣壳的构建的vp蛋白(vp1、vp2和vp3)。

2、野生型aav在没有辅助病毒(如腺病毒(ad)和单纯疱疹病毒(hsv))的情况下无法复制。腺病毒辅助基因已确定为aav复制所必需和充分条件，其包含e1a、e1b、e2a、e4和va。腺病毒5型(ad5)5'4.3kb基因组dna已经整合到人胚胎肾293(hek293)细胞的19号染色体中。此ad5基因组片段表达所有e1a(例如289r、243r、171r)以及e1b(例如19k和55k)亚型。已经开发了具有e1a和e1b整合的其他细胞系，包含例如per.c6细胞和细胞。参见例如fallaux等人，《人类基因疗法(human gene ther)》9(13):1909-1917(1998)和schiedner等人，《人类基因疗法》11(15):2105-2116(2000)。因此，这些细胞已经表达e1a和e1b，从而可以通过“三重质粒转染”方法支持重组aav(raav)的生产，即转染仅编码e2a、e4orf6和va的辅助质粒(phelper)，以及编码rep和cap基因(prepcap)和目标基因(paav-goi)的质粒。这种具有基因组整合的e1a和e1b基因并且天然表达e1a和e1b蛋白的细胞称为“e1互补产生细胞”。

3、目前，世界上超过70％的基于aav的基因治疗管道依赖于通过标准三重质粒转染方法在hek293细胞中瞬时转染的制造平台。hek293和其他e1互补产生细胞制造平台的生产率可能无法满足对aav不断增长的需求，例如用于临床开发和商业化。然而，目前用于增加e1互补产生细胞，如hek293细胞中aav生产率的方法(例如高生产细胞克隆筛选和分离、转染方案优化和制造工艺开发)是昂贵且耗时的。

技术实现思路

1、在一些实施例中，本公开提供了一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用一种或多种载体转染e1互补产生细胞，所述载体包括：(i)e1a腺病毒辅助基因；(ii)选自e2a、e4或两者的腺病毒辅助基因；(iii)病毒相关的非编码rna(varna)；和(iv)选自rep、cap或两者的aav基因；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；以及(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。

2、在另外的实施例中，本公开提供了一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用以下物质转染e1互补产生细胞：(i)包括与第一启动子可操作地连接的e1a的第一载体；(ii)包括e2a、e4和病毒相关的非编码rna(va rna)的第二载体，所述e2a、e4和varna全部可操作地连接到第二启动子；和(iii)包括rep和cap的第三载体，所述rep和cap两者均可操作地连接到第三启动子，其中(i)与(ii)和(iii)中的每一种的转染比为约1:1至约3:1；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；以及(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。合适地，第一、第二或第三载体中的一种或多种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。合适地，e1b是e1b-19k或e1b-55k。合适地，辅助基因包括np1和ns2的组合。在实施例中，该方法进一步包括用包括goi的载体转染e1互补产生细胞。

3、在进一步的实施例中，本公开提供了一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用以下物质转染e1互补产生细胞：(i)包括与第一启动子和增强子可操作地连接的e1a的第一载体；(ii)包括e2a、e4和病毒相关的非编码rna(va rna)的第二载体，所述e2a、e4和va rna全部可操作地连接到第二启动子；和(iii)包括rep和cap的第三载体，所述rep和cap各自可操作地连接到第三启动子；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞，其中e1a以与e2a、e4、va rna、rep和cap中的每一种的约1:1至约3:1的比率表达；以及(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。合适地，第一、第二或第三载体中的一种或多种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。合适地，e1b是e1b-19k或e1b-55k。合适地，辅助基因包括np1和ns2的组合。在实施例中，该方法进一步包括用包括goi的载体转染e1互补产生细胞。

4、在又进一步的实施例中，本公开提供了一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：(a)用以下物质转染e1互补产生：(i)包括e1a、e2a、e4和va rna的第一载体，所述e1a、e2a、e4和varna全部可操作地连接到第一启动子；以及(ii)包括rep和cap的第二载体，所述rep和cap可操作地连接到第二启动子，其中e1a与e2a、e4、varna、rep和cap中的每一个的拷贝数比为约1:1至约3:1；(b)在适于生产aav的条件下培养经转染的e1互补产生细胞；和(c)从培养的e1互补产生细胞中纯化aav，从而获得aav。合适地，第一和第二载体中的一种或两种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。合适地，e1b是e1b-19k或e1b-55k。合适地，辅助基因包括np1和ns2的组合。在实施例中，该方法进一步包括用包括goi的载体转染e1互补产生细胞。

1.一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)在单个载体上。

3.根据权利要求1所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)在多于一个载体上。

4.根据权利要求3所述的方法，其中(i)、(ii)和(iii)在第一载体上并且(iv)是第二载体。

5.根据权利要求3所述的方法，其中(i)在第一载体上，(ii)和(iii)在第二载体上，并且(iv)在第三载体上。

6.根据权利要求3所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的每一个在单独的载体上。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一种以约1:1至约5:1的比率转染到所述e1互补产生细胞中。

8.根据权利要求7所述的方法，其中转染到所述e1互补产生细胞中的包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个的比率是1:1。

9.根据权利要求7所述的方法，其中转染到所述e1互补产生细胞中的包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个的比率是2:1。

10.根据权利要求7所述的方法，其中转染到所述e1互补产生细胞中的包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个的比率是3:1。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)可操作地连接到一个或多个启动子。

12.根据权利要求11所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的每一个可操作地连接到单独的启动子。

13.根据权利要求12所述的方法，其中与可操作地连接到(ii)、(iii)和(iv)的启动子相比，可操作地连接到(i)的启动子提供基本上相同的表达水平。

14.根据权利要求12所述的方法，其中与可操作地连接到(ii)、(iii)和(iv)的启动子相比，可操作地连接到(i)的启动子提供至少2倍的表达。

15.根据权利要求12所述的方法，其中与所述可操作地连接到(ii)、(iii)和(iv)的启动子相比，所述可操作地连接到(i)的启动子提供至少3倍的表达。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中(i)可操作地连接到启动子，并进一步可操作地连接到增强子，并且其中(ii)、(iii)和(iv)未可操作地连接到增强子。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在所述一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比为约1:1至约5:1。

18.根据权利要求17所述的方法，其中在所述一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比是1:1。

19.根据权利要求17所述的方法，其中在所述一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比是2:1。

20.根据权利要求17所述的方法，其中在所述一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比是3:1。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中(ii)包括e2a和e4。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中(iv)包括rep和cap。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述培养包括以与(ii)、(iii)和(iv)中的每一种的约1:1至约5:1的比率表达e1a。

24.根据权利要求23所述的方法，其中e1a的表达与(ii)、(iii)和(iv)中的每一种的表达的比率是1:1、2:1或3:1。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述一个或多个载体进一步包括(v)选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述e1b是e1b-19k或e1b-55k。

27.根据权利要求25所述的方法，其中(v)包括np1和ns2。

28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中(i)和(v)在单个载体上。

29.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中(v)位于与(i)、(ii)、(iii)和(iv)分开的载体上。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述一个或多个载体进一步包括目标基因。

31.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其进一步包括用包括目标基因的载体转染所述e1互补产生细胞，其中所述基因或目标基因位于与(i)、(ii)、(iii)和(iv)分开的载体上。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中与不包括用e1a腺病毒辅助基因转染e1互补产生细胞的方法相比，所述方法生产至少1.5倍或更高滴度的aav。

33.一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：

34.一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：

35.一种在e1互补产生细胞中生产腺相关病毒(aav)的方法，其包括：

36.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述第一、第二或第三载体中的一种或多种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述第一或第二载体中的一种或两种进一步包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因。

38.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其进一步包括用包括选自e1b、np1、ns2或其组合的辅助基因的载体转染所述e1互补产生细胞。

39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述e1b是e1b-19k或e1b-55k。

40.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述辅助基因包括np1和ns2的组合。

41.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其进一步包括用包括目标基因的载体转染所述e1互补产生细胞。

42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述e1互补产生细胞是hek293细胞、911细胞、ptg6559细胞、per.c6细胞、gh329细胞、细胞、hela-e1细胞、ur细胞、vli-293细胞、ac51细胞、ac139细胞或其变体或衍生物。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述e1互补产生细胞是hek293细胞、per.c6细胞或细胞。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述e1互补产生细胞是hek293细胞。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述hek293细胞是hek293s细胞、hek293t细胞、hek293f细胞、hek293ft细胞、hek293ftm细胞、hek293sg细胞、hek293sggd细胞、hek293h细胞、hek293e细胞、hek293msr细胞、hek293a细胞或其组合。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述hek293细胞是hek293t细胞。

47.根据权利要求43所述的方法，其中所述e1互补产生细胞是per.c6细胞。

48.根据权利要求43所述的方法，其中所述e1互补产生细胞是细胞。