向导RNA设计及用于V型Cas系统的复合物的制作方法

本发明涉及基因编辑领域。

背景技术：

1、研究人员正在积极地探索成簇规律间隔短回文重复(crispr)系统的使用，以便修饰dna。到目前为止，在此领域中的绝大部分工作已放在cas9系统中。在这些系统中，核苷酸的两个单独链或单链核苷酸的区域形式的tracrrna(反式激活crispr rna)和crrna(crispr rna)杂交以招募cas9蛋白，然后将cas9蛋白引导至与crrna内部的序列互补的dna位置。因此，dna内部的互补序列变成靶位点，并且cas9蛋白基于其功能结构域可在此靶位点处引发编辑。

2、尽管现在充分认可了cas9系统的能力，但这些系统并非在所有用途中都是有效的。cas9系统的局限之一是cas9系统可对其起作用的功能结构域由所使用的cas9蛋白的功能结构域所限定。

3、其他的cas蛋白是已知的。在这些其他的cas蛋白中，尚未对它们的潜力进行充分发掘，它们是在v型家族中。当人们试图在靶位点或其附近引入多个编辑时，来自v型家族的酶的使用尤其未得到充分发掘。因此，有需求开发改进的grna(向导rna)和复合物以及包含并使用它们的系统。

技术实现思路

1、本发明提供新型且非显而易见的grna-配体结合复合物、碱基编辑复合物，以及用于碱基编辑和基因组修饰的方法。通过使用本发明各种实施方式，技术人员能够高效地且有效地离体、在体外、和在体内引发碱基编辑。此外，本发明的一些实施方式提供了模块化设计，这些设计允许将相同的v型cas蛋白引导至不同的靶向位点，并且可选地在相同或不同位点与不同的效应蛋白结合。

2、根据第一实施方式，本发明提供一种grna-配体结合复合物，其中，该grna-配体结合复合物包含：(a)grna，其中，该grna含有60至210个核苷酸或80至180个核苷酸，并且该grna包含(i)crrna序列，其中，该crrna序列的长度为36至60个核苷酸或35至60个核苷酸，并且该crrna序列包含cas结合区(其中，该cas结合区的长度为18至30个核苷酸)和靶向区(其中，该靶向区的长度为18至30个核苷酸)，以及(ii)tracrrna序列，其中，该tracrrna序列的长度为45至120核苷酸，并且其中，该tracrrna序列包含反重复区和远端区，其中，在cas结合区的超过至少18个连续核苷酸上，反重复区与cas结合区至少80％互补，并且cas结合区和反重复区能够杂交形成杂交区，其中，该杂交区能够保持与v型cas蛋白的rna结合结构域的结合；以及(b)配体结合基团，其中，配体结合基团(i)直接结合grna，或者(ii)通过接头结合grna。

3、根据第二实施方式，本发明提供一种碱基编辑复合物，包含：本发明的grna-配体结合复合物和v型cas蛋白，其中，grna-配体结合复合物的cas结合区和反重复区与v型cas蛋白结合。可选地，配体结合基团与配体可逆地结合,该配体附接效应分子到或者是效应分子的一部分。

4、根据第三实施方式，本发明提供一种用于碱基编辑的方法。该方法包括将本发明的碱基编辑复合物暴露于双链dna(“dsdna”)或单链dna(“ssdna”)。该碱基编辑复合物可在允许碱基编辑的条件下暴露于dsdna或ssdna。

5、根据第四实施方式，该grna-配体结合复合物包含或编码seq id no:28。

6、根据第五实施方式，该grna-配体结合复合物包含或编码seq id no:59至seq idno:65中的任一个。

7、根据第六实施方式，该grna-配体结合复合物包含或编码seq id no:67至seq idno:71中的任一个。

8、当效应物附接到(或含有)配体时，该系统具有模块化设计。该配体结合基团存在于grna-配体结合复合物内部，从而允许该复合物合与相应的结合有(或包含于其内部)效应物的配体结合。因此，配体结合基团以允许其能够与配体结合的方式和方位与grna结合。类似地，该配体以使得它能够与配体结合基团可逆地结合的方式附接或者与效应物结合。

9、当配体与配体结合基团彼此结合时，与配体结合的效应物将变成含有grna-配体结合复合物的任何碱基编辑复合物的一部分。当碱基编辑复合物还含有cas蛋白时，该cas蛋白和效应物可以被保留在相同的位置，例如，在目的靶位点或附近。

10、因此，如果技术人员希望使用带cas蛋白的特定效应物，其只需使该效应物与能够与配体结合基团可逆地结合的配体结合,该配体结合基团是含有该cas蛋白的碱基编辑复合物的一部分。为了将效应物从一个系统改换至下一个系统，技术人员只需改变效应物-配体。因而，技术人员可以使用相同的grna-配体结合复合物以及相关的带有多个不同效应物的cas蛋白。通过结合和分离它们的配体与配体结合基团，在相同的系统中可以相继地使用多个不同的效应物，或者在不同的系统中同时或相继地使用。

技术特征：

1.一种grna-配体结合复合物，其中所述grna-配体结合复合物包含：

2.根据权利要求1所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna由核苷酸单链形成，且所述核苷酸单链包括所述crrna序列和所述tracrrna序列。

3.根据权利要求2所述的grna-配体结合复合物，其中所述cas结合区与所述反重复区之间存在环序列。

4.根据权利要求3所述的grna-配体结合复合物，其中所述环序列的长度为4至40个核苷酸。

5.根据权利要求1所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna由第一核苷酸链和第二核苷酸链组成，其中所述第一核苷酸链包含所述tracrrna序列，且所述第二核苷酸链包含所述crrna序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna和所述配体结合基团中的至少一个包含至少一个修饰。

7.根据权利要求3所述的grna-配体结合复合物，其中所述环序列包含至少一个修饰。

8.根据权利要求7所述的grna-配体结合复合物，其中所述至少一个修饰是1至30个2'修饰。

9.根据权利要求8所述的grna-配体结合复合物，其中所述1至30个2'修饰是1至10个2'修饰。

10.根据权利要求9所述的grna-配体结合复合物，其中所述1至10个2'修饰位于所述靶向区中。

11.根据权利要求9所述的grna-配体结合复合物，其中所述1至10个2'修饰位于所述cas结合区中。

12.根据权利要求9所述的grna-配体结合复合物，其中所述1至10个2'修饰位于所述反重复区中。

13.根据权利要求9所述的rna-配体结合复合物，其中所述1至10个2'修饰位于所述远端区中。

14.根据权利要求7所述的grna-配体结合复合物，其中所述至少一个修饰是至少一个硫代磷酸酯连接。

15.根据权利要求6所述的grna-配体结合复合物，其中所述至少一个修饰是至少一个硫代磷酸酯连接。

16.根据权利要求15所述的grna-配体结合复合物，其中所述硫代磷酸酯连接位于所述靶向区中。

17.根据权利要求15所述的grna-配体结合复合物，其中所述硫代磷酸酯连接位于所述cas结合区中。

18.根据权利要求15所述的grna-配体结合复合物，其中所述硫代磷酸酯连接位于所述反重复区中。

19.根据权利要求15所述的grna-配体结合复合物，其中所述硫代磷酸酯连接位于所述远端区中。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述配体结合基团包括核苷酸序列，且所述配体结合基团的核苷酸序列包含至少一个2'修饰核苷酸。

21.根据权利要求20所述的grna-配体结合复合物，其中在所述配体结合基团中的所述2'修饰核苷酸是2'-o-甲基修饰核苷酸、2'-氟修饰核苷酸或2-氨基嘌呤修饰核苷酸。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述配体结合基团包含硫代磷酸酯连接。

23.根据权利要求2所述的rna-配体结合复合物，其中所述grna具有5'末端，且所述配体结合基团在grna的5'末端直接结合至所述grna。

24.根据权利要求2所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna具有3'末端，且所述配体结合基团在grna的3'末端直接结合至所述grna。

25.根据权利要求2所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna具有3'末端和5'末端，且所述配体结合基团直接结合所述grna的3'末端和5'末端之外的核苷酸。

26.根据权利要求25所述的rna-配体结合复合物，其中所述配体结合基团直接结合所述靶向区中的grna。

27.根据权利要求25所述的grna-配体结合复合物，其中所述配体结合基团直接结合所述cas结合区中的grna。

28.根据权利要求25所述的grna-配体结合复合物，其中所述配体结合基团直接结合所述反重复区中的grna。

29.根据权利要求25所述的grna-配体结合复合物，其中所述配体结合基团直接结合所述远端区中的grna。

30.根据权利要求3所述的grna-配体结合复合物，其中所述配体结合基团直接结合所述环序列处的grna。

31.根据权利要求1所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna包含环序列，且所述配体结合基团直接结合所述环序列处的grna。

32.根据权利要求1至22中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna-配体结合复合物包含所述接头，且所述配体结合基团通过所述接头结合所述grna。

33.根据权利要求2所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna具有5'末端，且所述接头在所述grna的5'末端结合所述grna。

34.根据权利要求32所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna具有3'末端，且所述接头在所述grna的3'末端结合所述grna。

35.根据权利要求32所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna具有3'末端和5'末端，且所述接头在所述3'末端或所述5'末端外的核苷酸处结合所述grna。

36.根据权利要求35所述的grna-配体结合复合物，其中所述接头在所述靶向区中结合所述grna。

37.根据权利要求35所述的grna-配体结合复合物，其中所述接头在所述cas结合区中直接结合所述grna。

38.根据权利要求35所述的rna-配体结合复合物，其中所述接头在所述反重复区中直接结合所述grna。

39.根据权利要求35所述的grna-配体结合复合物，其中所述接头在所述远端区中结合所述grna。

40.根据权利要求2所述的grna-配体结合复合物，其中在所述cas结合区与所述反重复区之间存在环序列，且所述grna-配体结合复合物包含所述接头，其中所述接头结合所述环序列。

41.根据权利要求32至40中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述接头选自由经修饰和无修饰的寡核苷酸、经修饰和无修饰的寡肽、无机基团、经修饰和无修饰的多糖、经修饰和无修饰的脂、及其组合所组成的组。

42.根据权利要求41所述的grna-配体结合复合物，其中所述接头包含经修饰的寡核苷酸序列，其中所述经修饰的寡核苷酸序列包含2'修饰和硫代磷酸酯连接中的至少一个。

43.根据根据权利要求32至40中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述接头包含乙酰丙酸基团。

44.根据权利要求32至40中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述接头包含乙二醇基团。

45.根据权利要求32至40中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述接头选自由18s、9s或c3组成的组。

46.根据权利要求32至40中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述接头是长度为1至24个核苷酸的核苷酸序列。

47.根据权利要求1至46中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述配体结合基团包含生物素或链霉亲和素。

48.根据权利要求1至46中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述配体结合基团能够与选自以下项组成组中的配体结合：ms2、ku、pp7、sfmu、sm7、tat、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、csy4、qβ、com、pumilio、抗-his tag(6h7)、λn22+、snap-tag、凝集素和pdgfβ-链。

49.根据权利要求48所述的grna-配体结合复合物，其中所述配体是ms2。

50.根据权利要求1至49中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述配体结合基团包含5'修饰核苷酸，其中所述5'修饰核苷酸包含2'修饰、5'po4基团或含氮碱基修饰中的至少一种。

51.根据权利要求32至50中任一项所述的grna-配体结合复合物，其中所述配体结合基团是第一配体结合基团，且所述grna-配体结合复合物包含第二配体结合基团，且其中所述接头是第一接头，且所述grna-配体结合复合物包含第二接头，其中所述第一配体结合基团附接所述第一接头，且所述第二配体结合基团附接所述第二接头。

52.根据权利要求51所述的grna-配体结合复合物，其中所述第一接头和所述第二接头各自附接所述crrna序列。

53.根据权利要求51所述的rna-配体结合复合物，其中所述第一接头和所述第二接头各自附接所述tracrrna序列。

54.根据权利要求51所述的grna-配体结合复合物，其中所述第一接头和所述第二接头中的一个接头附接所述crrna序列，并且所述第一接头和所述第二接头中的另一个接头附接所述tracrrna序列。

55.根据权利要求3所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna-配体结合复合物包含所述接头，且所述配体结合基团是第一配体结合基团，且所述grna-配体结合复合物包含第二配体结合基团，且其中所述接头是第一接头，且所述grna-配体结合复合物包含第二接头，其中所述第一配体结合基团附接所述第一接头，且所述第二配体结合基团附接所述第二接头，且所述第一接头附接所述环序列。

56.根据权利要求55所述的grna-配体结合复合物，其中所述第二接头附接所述crrna序列。

57.根据权利要求56所述的grna-配体结合复合物，其中所述第二接头附接所述tracrrna序列。

58.根据权利要求1所述的grna-配体结合复合物，其中所述配体结合基团是ms2，且所述配体结合基团包含长度为1至12个核苷酸的上游序列及长度为1至12个核苷酸的下游序列，其中所述上游和下游序列紧邻所述ms2的两侧，且所述上游序列与所述下游序列互补。

59.根据权利要求58所述的grna-配体结合复合物，其中每个所述上游序列和所述下游序列的的长度均为2个核苷酸。

60.根据权利要求59所述的grna-配体结合复合物，其中每个所述上游序列和所述下游序列均为gc。

61.根据权利要求1所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna-配体结合复合物包含或编码seq id no:28。

62.根据权利要求1所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna-配体结合复合物包含或编码seq id no:59至seq id no:65中的任一个。

63.根据权利要求1所述的grna-配体结合复合物，其中所述grna-配体结合复合物包含或编码seq id no:67至seq id no:71中的任一个。

64.一种碱基编辑复合物，包含：

65.根据权利要求64所述的碱基编辑复合物，其中所述v型cas蛋白是切割酶。

66.根据权利要求64所述的碱基编辑复合物，其中所述v型cas蛋白包含活性ruvc结构域。

67.根据权利要求64所述的碱基编辑复合物，其中所述v型cas蛋白包含失活的ruvc结构域。

68.根据权利要求64至67中任一项所述的碱基编辑复合物，其中所述v型cas蛋白选自由cas12b、cas12e和cas12f组成的组。

69.根据权利要求64至68中任一项所述的碱基编辑复合物，还包含效应物，其中所述效应物附接所述配体结合基团配体，且所述配体结合基团配体能够与所述配体结合基团结合。

70.根据权利要求69所述的碱基编辑复合物，其中所述效应物选自由脱氨酶、逆转录酶转录调节剂和修复酶组成的组。

71.根据权利要求69所述的碱基编辑复合物，其中所述效应物选自由aid、cda、apobec1、apobec3a、apobec3b、apobec3c、apobec3d、apobec3f、apobec3g、apobec3h、ada、adar1、tada、tada、tad3，adar2、adar3、dnmt1、dnmt3a、tet1、tet2和tdg组成的组。

72.根据权利要求69至71中任一项所述的碱基编辑复合物，其中所述配体是mcp。

73.根据权利要求64至72中任一项所述的碱基编辑复合物，还包含半胱氨酸/硒代半胱氨酸标签。

74.根据权利要求64至72中任一项所述的碱基编辑复合物，还包括用于通过点击化学进行环加成的元件。

75.根据权利要求64至72中任一项所述的碱基编辑复合物，其中所述效应物是第一效应物，且所述碱基编辑复合物还包含第二效应物。

76.根据权利要求75所述的碱基编辑复合物，其中所述第二效应物是以共价键或以非共价键方式直接或者通过中间基团结合所述v型cas蛋白。

77.一种用于碱基编辑的方法，包括将权利要求64至76中任一项所述的的碱基编辑复合物暴露于双链dna。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述方法在体外进行。

79.根据权利要求77所述的方法，其中所述方法在体内进行。

80.根据权利要求77所述的方法，其中所述方法离体进行。

81.一种用于碱基编辑的方法，包括将权利要求65至77中任一项所述的碱基编辑复合物暴露于单链dna。

82.根据权利要求82所述的方法，其中所述方法在体外进行。

83.根据权利要求82所述的方法，其中所述方法在体内进行。

84.根据权利要求82所述的方法，其中所述方法离体进行。

85.一种在细胞中编辑dna的方法，所述方法包括将权利要求65至77中任一项所述的碱基编辑复合物暴露于所述细胞。

86.根据权利要求86所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。

87.根据权利要求86所述的方法，其中所述免疫细胞是t细胞。

88.根据权利要求86所述的方法，其中所述免疫细胞是ipsc细胞。

89.一种治疗受试者的方法，所述方法包括权利要求77所述的方法，其中所述暴露发生在受试者体外，并且在所述暴露之后，将所述细胞输注到所述受试者中。

技术总结
本发明提供了一种新型gRNA‑配体结合复合物。此复合物可用于将V型Cas蛋白和额外的效应物带到DNA中进行碱基编辑。该系统的设计允许生产在编辑DNA时提供灵活性的高效模块化组分。

技术研发人员：H·B·马查多,K·亨普希尔,R·布拉斯伯格,A·史密斯,M·D·拉什顿,P·佩雷斯-杜兰
受保护的技术使用者：地平线探索有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15