增强的链接靶标捕获的制作方法

本发明总体上涉及核酸的捕获、扩增和测序。

背景技术：

1、以足够的灵敏度捕获和测序靶标核酸和区域并同时避免脱靶相互作用对于精确且有成本效益的研究和诊断仍然极其重要。然而，平衡灵敏度和特异性可能是困难的，并且期望的平衡可能取决于应用而有所不同。

2、适应性免疫系统在抵抗病原体方面发挥着关键作用。适应性免疫系统的基础是t细胞和b细胞，它们在其发育过程中采用用v(d)j重组以产生大量的t细胞受体和b细胞受体(针对t细胞产生t细胞受体，而针对b细胞产生抗体/免疫球蛋白)。这些受体可以适应新的病原体以中和它们，并且因此，对单个细胞中的重组或跨多个细胞的所有重组的全组库进行测序是非常令人感兴趣的。适应性免疫系统的测序可以阐明免疫反应，并且可以用来改善健康结果，包括诊断当前疾病、检测对先前疾病(例如，暴露于(sars-cov-2))的免疫反应、确定疫苗接种状态、为疫苗开发提供信息和帮助、确定疾病治疗、检测新型病原体、预防疾病、以及检测疾病复发。然而，目前仍然缺乏具有成本效益、精确且灵敏的方法以捕获重组的全部组库。

3、灵敏度在其中很重要的另一种情况是病原体检测，其中可以使用广谱检测来标识多种病毒、细菌、真菌、原生动物或类病毒的存在，这些病毒、细菌、真菌、原生动物或类病毒可能具有有限的保守区和可变区，因此难以进行普遍检测。

4、测序的另一个发展中的应用是空间测序。空间测序是一个广泛的方法集合，通常允许确定关于特定细胞或亚细胞位置的rna序列。这些方法可以是广泛的(整个转录组)或靶向的，但通常限于rna测序，因为其丰度高且相对容易捕获(例如，多聚腺苷酸尾(polyatails))。用于高分辨率空间dna测序的方法层出不穷，但均受限于其靶向特定区域的能力。

5、例如，payne等人在“原位基因组测序解析了在完整生物样本中的dna序列和结构(in situ genome sequencing resolves dna sequence and structure in intactbiological samples)”，科学(science),第371卷,第6532期,2021,doi:10.1126/science.aay3446中使用了滚环扩增以及通用引物以扩增所有可用的dna序列。其通过引用并入本文。

技术实现思路

1、本发明的系统和方法提供了适用于多种测序应用的具有程序化灵敏度和特异性的链接靶标捕获技术。在一些实施例中，链接靶标捕获探针可以被设计成以在可变(v)、连接(j)、恒定(c)区或多样性(d)基因区中的各种序列为靶标，使得链接靶标捕获探针的组合可以在单一反应中靶向来自t细胞和b细胞的所有可能的v和j组合。因此，本发明的系统和方法可以提供适应性免疫系统的稳健图谱。

2、在一些实施例中，本发明的系统和方法可以通过设计用于靶向病原体序列的链接靶标捕获探针而应用于病原体检测。探针可以针对保守区来设计，例如在细菌中的16s或18s基因以及在真菌中的its基因，使得单个探针或一小组探针可以检测大范围的病原体。因为在链接靶标捕获中使用的探针不需要启动pcr引发，所以捕获探针可以与靶标序列具有可变的同源性。可以通过设计靶向可变区但仅需要部分匹配便可以成功捕获靶标的捕获探针来检测大范围的病原体。

3、本发明的链接靶标捕获技术也可以与环状模板一起使用。在一些实施例中，可以将链接靶标捕获应用于环状模板以靶向用于空间测序的dna。链接靶标捕获探针可以为基于滚环的空间dna分析提供增加的特异性。

4、在一些实施例中，本发明的链接靶标捕获技术可以应用于突变特异性富集。靶标特异性探针可以是突变特异性的，使得野生型和脱靶的序列不会被捕获、扩增和测序。因此，通过避免传统的扩增、以及对在靶标基因座处的所有dna进行测序、并且然后通过序列分析来确定突变，可以减少时间和成本。

1.一种用于描绘适应性免疫系统的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个链接捕获探针包括靶向所有v基因区的捕获探针。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述多个链接捕获探针进一步包括靶向所有j基因区的捕获探针。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个链接捕获探针包括靶向所有c基因区的捕获探针。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个链接捕获探针包括靶向所有d基因区的捕获探针。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个链接捕获探针包括靶向在所述v、j、c或d基因区中的一个或多个基因区内的多个亚区的捕获探针。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述多个亚区中的每个亚区与所述多个亚区中的另一个亚区重叠。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述多个亚区中的每个亚区与所述多个亚区中的另一个亚区重叠5个或更多个碱基。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一个或多个淋巴细胞是t细胞。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一个或多个淋巴细胞是b细胞。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一个或多个淋巴细胞包括b细胞和t细胞两者。

12.根据权利要求1所述的方法，进一步包括基于所述受试者的适应性免疫系统图谱来检测所述受试者对于病原体的暴露。

13.根据权利要求1所述的方法，进一步包括基于所述受试者的适应性免疫系统图谱来确定所述受试者的疫苗接种状态。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述附着步骤包括连接、pcr扩增、模板转换或用转座酶进行的转座。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸片段包括dna、rna或cdna中的一种或多种。

16.一种用于病原体检测的方法，所述方法包括：

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述靶标探针与多种病原体的可变区具有可变的同源性。

18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述靶标探针对从由16s、18s和its基因组成的群组选择的保守区具有亲和力。

19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述附着步骤包括连接、pcr扩增、模板转换或用转座酶进行的转座。

20.一种用于核酸的靶向捕获的方法，所述方法包括：

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述环状核酸模板在细胞中位于原位。

22.根据权利要求21所述的方法，还包括使用空间测序分析来标识所述核酸序列和在所述细胞内的位置。

23.一种用于核酸的靶向捕获的方法，所述方法包括：

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述样本是来自受试者的生物样本，并且所述突变体等位基因与肿瘤相关。

25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述靶标探针包括锁核酸。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述靶标探针与包括点突变的突变体序列互补，并且所述锁核酸位于所述靶标探针的对应于所述点突变的位置。