胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其用途的制作方法

本文描述了至少一种新型胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶多肽及其用途。本文进一步描述了含有本文所述的具有丝氨酸蛋白酶活性的至少一种多肽的清洁组合物，其中所述组合物可用于清洁织物或硬表面。本文甚至进一步描述了至少一种清洁组合物，所述至少一种清洁组合物选自衣物洗涤剂、餐具洗涤剂(例如，自动餐具和手洗餐具)、以及个人护理组合物。甚至仍进一步，本文描述了与具有丝氨酸蛋白酶活性的至少一种参比多肽相比，具有丝氨酸蛋白酶活性和改善的污垢去除性和/或稳定性的至少一种多肽。

背景技术：

1、蛋白酶(protease)(也称为肽酶或朊酶(proteinase))是一种能够切割肽键的酶。蛋白酶经过多次进化，且不同种类的蛋白酶可以通过完全不同的催化机制进行相同的反应。蛋白酶可以在动物、植物、真菌、细菌、古细菌和病毒中找到。

2、蛋白水解可通过目前分为以下六大组的酶实现：天冬氨酰蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(例如像，枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶)、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。

3、丝氨酸蛋白酶属于羰基水解酶亚组，其包含具有广泛特异性和生物学功能的不同类别的酶。尽管存在这种功能多样性，但丝氨酸蛋白酶的催化机制已与至少两种遗传上不同的酶家族接近：1)枯草杆菌蛋白酶；和2)胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(也称为胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶)。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸内肽酶这两个家族具有非常相似的催化机制。这两个酶家族的三级结构汇集了由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸组成的氨基酸的保守的催化三联体。

4、已经对丝氨酸蛋白酶(特别是枯草杆菌蛋白酶)进行了大量研究，这主要归因于它们在工业应用中有用。另外的工作集中于不利的环境条件(例如，暴露于氧化剂、螯合剂、极端温度和/或ph)，这些条件可能在各种应用中不利地影响这些酶的功能。

5、因此，对寻找新的丝氨酸蛋白酶(例如，原核生物起源的胰蛋白酶样蛋白酶)存在持续需求，这些新的丝氨酸蛋白酶可以在不利条件下使用并且保留或具有改善的蛋白水解活性和/或稳定性。

技术实现思路

1、在第一实施例中，描述了具有丝氨酸蛋白酶活性的至少一种分离的多肽，其中所述多肽包含与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

2、在另一个实施例中，本公开提供了重组构建体，其包含在生产宿主中起作用的调控序列，所述调控序列可操作地连接到编码至少一种多肽的核苷酸序列，所述至少一种多肽具有与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

3、在又另一个实施例中，本公开提供了包含重组核酸构建体的宿主细胞，所述重组核酸构建体包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，所述核苷酸序列可操作地连接到能够控制所述多核苷酸序列的表达的启动子序列。

4、本文提供的另外的实施例包括用于产生至少一种多肽的方法，这些方法包括：(a)用所述重组构建体转化生产宿主，所述重组构建体包含在生产宿主中起作用的调控序列，所述调控序列可操作地连接到编码至少一种多肽的核苷酸序列，所述至少一种多肽具有与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；以及(b)在产生至少一种多肽的条件下培养步骤(a)的生产宿主。

5、还提供了包括清洁组合物或洗涤剂组合物的组合物，这些清洁组合物或洗涤剂组合物包含至少一种多肽以及任选地至少一种表面活性剂和/或至少一种分散剂，该至少一种多肽具有与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

6、在另一个实施例中，本公开提供了清洁的方法，所述方法包括使需要清洁的表面或物品与有效量的具有丝氨酸蛋白酶活性的至少一种多肽或包含这样的多肽的组合物接触，其中所述多肽包含与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且所述方法任选地进一步包括以下步骤：在使所述表面或物品与所述多肽接触之后漂洗所述表面或物品。

7、附图和序列的说明

8、图1.图1a提供了纯化的isppro1的质谱图。图1b通过凝胶过滤分离纯化的isppro1样品的一个实施例的分离的级分。图1c图1b中所示的分离的isppro1级分对偶氮酪蛋白的比活性。

9、图2.提供了pna-aapf测定中isppro1的剂量响应曲线的图示。

10、图3.提供了纯化的isppro1的ph曲线的图示。

11、图4.提供了纯化的isppro1的温度曲线的图示。

12、图5.提供了在gsm-d洗涤剂中在ph 10.9下isppro1对pa-s-38的清洁性能的实例的图示。

13、图6.图6a：提供了在tide hdl中在ph 8.0/16℃下isppro1对empa-116的清洁性能的实例的图示。图6b：提供了在tide hdl中在ph 8.0/32℃下isppro1对empa-116的清洁性能的实例。

14、图7.提供了在pnb hdl中在ph 8.2下isppro1对c-s-39的清洁性能的实例的图示。

15、图8.图8a：提供了在tide hdd中在ph 10.0/16℃下isppro1对empa-116的清洁性能的实例的图示。图8b：提供了在tide hdd中在ph 10.0/32℃下isppro1对empa-116的清洁性能的实例的图示。

16、图9.提供了在tide hdd中isppro1对c-s-01的清洁性能的实例的图示。

17、图10.提供了isppro1在缓冲液中的延长的稳定性的结果的图示。

18、图11.提供了isppro1在pnb洗涤剂中的长期储存稳定性测定的结果的图示。

技术特征：

1.一种具有丝氨酸蛋白酶活性的分离的多肽或其活性片段，其中所述多肽包含与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

2.一种具有丝氨酸蛋白酶活性的分离的多肽，其中所述多肽包含与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

3.一种重组构建体，其包含在生产宿主中起作用的调控序列，所述调控序列可操作地连接到编码至少一种多肽的核苷酸序列，所述至少一种多肽具有与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的重组构建体，其中所述宿主选自由以下组成的组：真菌、细菌和藻类。

5.一种包含重组核酸构建体的宿主细胞，所述重组核酸构建体包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，所述核苷酸序列可操作地连接到能够控制所述多核苷酸序列的表达的启动子序列。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中所述宿主选自由以下组成的组：真菌、细菌和藻类。

7.一种用于产生至少一种多肽的方法，所述方法包括：

8.如权利要求7所述的方法，其中所述多肽任选地从所述生产宿主回收。

9.一种含有丝氨酸蛋白酶的培养物上清液，所述培养物上清液通过如权利要求7或8所述的方法获得。

10.一种清洁组合物或洗涤剂组合物，所述清洁组合物或洗涤剂组合物包含至少一种多肽以及至少一种表面活性剂，所述至少一种多肽具有与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

11.如权利要求10所述的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：非离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、及其组合和混合物。

12.如权利要求10或11所述的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂是非离子醇乙氧基化物。

13.如权利要求10-12所述的清洁组合物或洗涤剂组合物，所述清洁组合物或洗涤剂组合物进一步包含具有蛋白酶活性的第二多肽；以及，任选地，至少一种另外的多肽，其中所述至少一种另外的多肽是选自由以下组成的组的酶：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、氨基己糖苷酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、核酸酶(例如脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶)、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚酯酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合或混合物。

14.如权利要求10-13所述的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述组合物包含按所述组合物的重量计约0.1％至约60％、约1％至约50％、或约5％至约40％的表面活性剂。

15.如权利要求10-14所述的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述组合物进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种辅助材料：助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、光学增亮剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、着色剂、填料盐、助水溶剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色点缀剂、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱性来源、增溶剂、载剂、加工助剂、颜料和ph控制剂。

16.一种清洁组合物或洗涤剂组合物，所述清洁组合物或洗涤剂组合物包含至少一种多肽以及至少一种分散剂或分散聚合物，所述至少一种多肽具有与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

17.如权利要求16所述的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述组合物进一步包含表面活性剂。

18.如权利要求17所述的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：非离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、及其组合和混合物。

19.如权利要求16-18所述的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂是非离子醇乙氧基化物。

20.如权利要求16-19所述的清洁组合物或洗涤剂组合物，所述清洁组合物或洗涤剂组合物进一步包含具有蛋白酶活性的第二多肽；以及，任选地，至少一种另外的多肽，其中所述至少一种另外的多肽是选自由以下组成的组的酶：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、氨基己糖苷酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、核酸酶(例如脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶)、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚酯酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合或混合物。

21.如权利要求16-20所述的清洁组合物或洗涤剂组合物，其中所述分散剂聚合物以按所述组合物的重量计约0.1％至约20％，优选地0.2％至约15％，更优选地0.3％至％的量存在于组合物中。

22.如权利要求16-21中任一项所述的组合物，其中所述组合物选自衣物洗涤剂、织物柔顺洗涤剂、餐具洗涤剂、和硬表面清洁洗涤剂。

23.如权利要求16-22中任一项所述的组合物，其中所述组合物是颗粒、粉末、固体、棒状、液体、片剂、凝胶、糊剂和/或单位剂量组合物。

24.一种清洁的方法，所述方法包括使需要清洁的表面或物品与有效量的具有丝氨酸蛋白酶活性的至少一种多肽接触，其中所述多肽包含与选自由seq id no:7、8和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且所述方法任选地进一步包括以下步骤：在使所述表面或物品与所述多肽接触之后漂洗所述表面或物品。

25.一种清洁的方法，所述方法包括使需要清洁的表面或物品与清洁组合物或洗涤剂组合物接触，所述清洁组合物或洗涤剂组合物包含至少一种多肽以及至少一种表面活性剂或分散剂聚合物，所述至少一种多肽具有与选自由seq id no:7和87、8、和13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且所述方法任选地进一步包括以下步骤：在使所述表面或物品与所述组合物接触之后漂洗所述表面或物品。

26.如权利要求24-25中任一项所述的方法，其中所述物品是餐具或织物。

技术总结
本文描述了至少一种新型胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶多肽及其用途。本文进一步描述了含有本文所述的至少一种多肽的清洁组合物，其中所述组合物可用于清洁织物和硬表面。本文甚至进一步描述了至少一种清洁组合物，所述至少一种清洁组合物选自衣物洗涤剂、餐具洗涤剂(例如，自动餐具和手洗餐具)、以及个人护理组合物。甚至仍进一步，本文描述了与至少一种参比多肽相比，具有改善的污垢去除性和/或稳定性的至少一种多肽。

技术研发人员：L·M·巴贝,X·古,T·卡佩尔
受保护的技术使用者：丹尼斯科美国公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15