抗-TM4SF4人源化抗体及其用途的制作方法

本发明涉及能够以高亲和力特异性结合于tm4sf4(四跨膜蛋白超家族成员4，transmembrane 4superfamily member 4)并人类显示出低免疫原性的人源化抗体及包含其的癌症的预防或治疗用组合物。

背景技术：

1、tm4sf4(四跨膜蛋白超家族成员4)是四跨膜蛋白(tetraspanin)蛋白质的一种，报道有该分类的其他蛋白质tm4sf1和tm4sf5在大多数的肿瘤中表达上调，并与上皮间质转化和细胞迁移相关，大量进行了癌细胞相关研究。有部分报告称tm4sf4在癌细胞中与细胞凋亡和分化以及细胞的侵袭能力相关，最近本发明的研究团队报告了在人肺癌细胞中tm4sf4蛋白促进癌干细胞生长、自我复制(self-renewal)能力和转移/浸润，并提示了tm4sf4促进作为对癌症发生而言重要的信号传递系统的igf1rβ/akt/nfκb或jak2(或fak)/st at3活化，由此通过被促进的细胞因子分泌而强化癌干细胞特性，从而使肿瘤进一步恶化(choisi et al.,oncotarget.2014；5(20):9823-9837,choi si etal.,oncotarget.2017；8(60):101284-101297)。

2、抗体由于对靶抗原的高结合特异性和在人体内的稳定性而作为治疗剂来应用。特别是，抗癌功能的抗体以抗体工程技术的发展为基础，被改善为人源化抗体、单链抗体、双重抗体、药物融合抗体等，大幅提高癌症治疗功效而被应用。但是，由于癌症特性的多样性和新抗原表达带来的治疗抗性诱导等，所以现有的以癌细胞为靶向而应用的抗原的种类被指出存在局限性，正在持续进行探索新型癌症特异抗原并导出针对它的抗体的研究。

3、特别是，报告了对现有的癌症治疗方法中正在应用的靶向药物或者放射线治疗显示抗性并复发的癌症的情况下，癌干细胞的特性发挥重要作用，能够以癌干细胞为靶向而应用的抗原的发掘和特异抗体的确保显得尤为重要。

4、另一方面，为了开发对特定抗原特异性地结合的单克隆抗体，主要利用以下方法：利用以人类以外的动物为对象注入抗原并通过动物的免疫系统而制造的抗体。但是，通过上述方法制造的抗体由于是来源于人类以外的动物的抗体，而非人类的蛋白质，因此，向人体进行给药时，会发生免疫原性(immunogeni city)的问题。即，来源于人类以外的物种的抗体对人体进行给药时，会诱导hama(人抗-小鼠抗体(human anti-mouse antibody))的发生，基于上述来源于异种的抗体的治疗功效会减少。

5、对此，提出了如下方法：在构成来源于上述人类以外的物种的抗体的氨基酸序列中，获得与抗原的结合发挥重要作用的序列，其余部分用人类抗体的序列来替换，从而解决前面说明的问题。但是，通过这种方法制造的嵌合体抗体(chimeric antibody)或人源化抗体(humanized antibody)由于融合了彼此不同的两种蛋白质区域，从而会产生无法作为抗体发挥作用或者对抗原的结合亲和力减少的可能性。因此，实际情况是开发出在人体中不诱导hama的发生且显示出对抗原的高特异性和亲和力的人源化抗体方面仍存在困难。

技术实现思路

1、技术课题

2、本发明的目的在于提供能够以高亲和力特异性地结合于在癌细胞的表面过表达而表现的tm4sf4(四跨膜蛋白超家族成员4)蛋白质且对人体进行给药时能够显示出低免疫原性的新型的人源化抗体或其抗原结合片段。

3、另外，本发明的目的在于提供编码上述人源化抗体或其抗原结合片段并使其表达的多核苷酸、表达载体、宿主细胞、以及上述生产人源化抗体或其抗原结合片段的方法。另外，本发明提供一种生产抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养上述宿主细胞的步骤。

4、另外，本发明的目的在于提供用于检测tm4sf4的用途的组合物、试剂盒、以及检测tm4sf4的方法。

5、另外，本发明的目的在于提供用于预防或治疗癌症的药物组合物、癌干细胞的生长抑制用组合物、以及放射线抗癌症治疗辅助用组合物。

6、课题解决手段

7、为了实现上述目的，提供人源化抗体或其抗原结合片段，其中，包括重链可变区和轻链可变区，上述重链可变区包含具有seq id no:1的氨基酸序列的fr-h1、具有seq idno:2或seq id no:3的氨基酸序列的fr-h2、具有seq id no:4的氨基酸序列的fr-h3和具有seq id no:5的氨基酸序列的fr-h4，上述轻链可变区包含具有seq id no:6的氨基酸序列的fr-l1、具有seq id no:7的氨基酸序列的fr-l2、具有seq id no:8的氨基酸序列的fr-l3和具有seq id no:9的氨基酸序列的fr-l4，并且上述人源化抗体或其抗原结合片段特异性地结合于tm4sf4(四跨膜蛋白超家族成员4(transmembrane 4superfamily member 4))。

8、本发明的另一方面提供包含编码上述人源化抗体或其抗原结合片段的碱基序列的多核苷酸、包含上述多核苷酸的表达载体、以及包含上述表达载体的宿主细胞。

9、本发明的另一方面提供包含上述人源化抗体或其抗原结合片段的tm4sf4检测用组合物和包含上述tm4sf4检测用组合物的tm4sf4检测用试剂盒。

10、本发明的另一方面提供一种检测tm4sf4的方法，其中，包括使人源化抗体或其抗原结合片段与预想包含tm4sf4的检测对象样品接触的步骤。

11、本发明的另一方面提供包含上述人源化抗体或其抗原结合片段的癌症的预防或治疗用药物组合物、癌干细胞生长抑制用组合物和放射线抗癌症治疗辅助用组合物。

12、发明效果

13、本发明的人源化抗体由于不结合于bsa之类的物质并能够特异性地结合于tm4sf4，所以能够检测tm4sf4或者能够以过表达tm4sf4的癌细胞、癌干细胞为靶向有效地使用。特别是，本发明的人源化抗体具有与来源于小鼠的抗体相似或者与嵌合体抗体相比结合亲和力明显高的特征，从而显示出优异的效果。

14、另外，本发明的人源化抗体是除了大部分的cdr序列以外的其余序列利用来源于人类抗体的氨基酸序列或者改变了其一部分，因此，即使对人体进行给药时，诱导hama(人抗-小鼠抗体(human anti-mouse antibody))的可能性低，因而免疫原性(immunogenecity)也低的效果。因此，本发明的人源化抗体具有能够解决因利用来源于小鼠的抗体而可能发生的免疫反应的问题的优点。

15、但是，本发明的效果不限于上述提及的效果，未提及的其他效果可以由下述的记载清楚地被本领域技术人员所理解。

技术特征：

1.一种人源化抗体或其抗原结合片段，其中，包括重链可变区和轻链可变区，

2.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区还包含选自由具有seq id no:10的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:77的氨基酸序列的cdr-h2和具有seq id no:14的氨基酸序列的cdr-h3组成的组中的至少一个cdr，

3.根据权利要求2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述cdr-h2具有选自由seq id no:11、seq id no:12和seq id no:13构成的组中的任一个氨基酸序列，或者所述cdr-l1具有选自由seq id no:15、seq id no:16和seq id no:17构成的组中的任一个氨基酸序列，或者所述cdr-l3具有seq id no:19的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区还包含具有seq id no:10的氨基酸序列的cdr-h1、具有seq id no:11的氨基酸序列的cdr-h2和具有seq id no:14的氨基酸序列的cdr-h3，

5.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区具有选自由seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22和seq id no:23组成的组中的任一个氨基酸序列，

6.根据权利要求1至5中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述人源化抗体还包含选自由具有seq id no:27的氨基酸序列的重链恒定区和具有seq id no:28的氨基酸序列的轻链恒定区构成的组中的至少一个。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段为选自由fab、f(ab')、f(ab')2和fv组成的组中的任一个。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段的平衡解离常数kd为2.4x10-8m以下。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸，其中，包含编码人源化抗体或其抗原结合片段的碱基序列。

10.一种表达载体，其中，包含权利要求9所述的多核苷酸。

11.一种宿主细胞，其中，包含权利要求10所述的表达载体。

12.一种生产人源化抗体或其抗原结合片段的方法，其中，包括培养权利要求10所述的宿主细胞的步骤。

13.一种tm4sf4检测用组合物，其中，包含权利要求1至5中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段。

14.一种tm4sf4检测用试剂盒，其中，包括权利要求13所述的tm4sf4检测用组合物。

15.一种检测tm4sf4的方法，其中，包括使权利要求1至权利要求5中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段与预想包含tm4sf4的检测对象样品接触的步骤。

16.一种癌症的预防或治疗用药物组合物，其中，包含权利要求1至权利要求5中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段。

17.根据权利要求16所述的癌症的预防或治疗用药物组合物，其中，所述癌症的预防或治疗是对选自由癌症治疗过程中的癌症化学抗性、癌症治疗后的癌症化学抗性、癌症复发和癌症转移组成的组中的至少一种进行预防或治疗。

18.根据权利要求16所述的癌症的预防或治疗用药物组合物，其中，所述癌症为选自由肺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、胰腺癌、大肠癌、结肠癌、食道癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、肝癌、头颈部癌、膀胱癌、前列腺癌、血癌、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、恶性淋巴瘤、胸腺癌、骨肉瘤、纤维腺瘤和脑癌组成的组中的至少一种。

19.一种癌干细胞生长抑制用组合物，其中，包含权利要求1至权利要求5中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段。

20.一种放射线抗癌症治疗辅助用组合物，其中，包含权利要求1至权利要求5中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段。

21.根据权利要求20所述的放射线抗癌症治疗辅助用组合物，其中，所述人源化抗体或其抗原结合片段增加癌细胞对放射线的敏感度，所述癌细胞包括癌干细胞。

技术总结
本发明涉及抗‑TM4SF4(四跨膜蛋白超家族成员4(TransMembrane 4Superfamily Member 4))人源化抗体及其用途，本发明的抗‑TM4SF4人源化抗体能够以高亲和力特异性结合于TM4SF4并对人类显示出低免疫原性，能够检测TM4SF4或者以过表达TM4SF4的癌细胞、癌干细胞为靶向有效地使用。

技术研发人员：金仁圭,柳春济,金珉奎,金来权,朴晃绪,崔文柱,甘然智,申秉澈,郑宇喜
受保护的技术使用者：韩国原子力研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25