阳离子脂质及其组合物的制作方法

背景技术：

1、基因疗法旨在改善患有因异常基因表达谱引起的基因病症或获得性疾病的患者的临床结果。迄今为止，已经开发出各种类型的基因疗法，它们将治疗性核酸作为治疗疾病的药物递送到患者的细胞中。

2、可以通过多种方法在患者的靶细胞中递送和表达校正基因，这些方法包括使用工程病毒基因递送载体，以及潜在的质粒、小基因、寡核苷酸、小环或各种末端封闭的dna。在许多可用的病毒来源载体(例如，重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)中，重组腺相关病毒(raav)作为基因疗法中一种通用且相对可靠的载体而获得认可。然而，病毒载体(诸如腺相关载体)可以是高免疫原性的，并引起可损害功效(特别是在再施用方面)的体液和细胞介导的免疫。

3、非病毒基因递送规避了与病毒转导相关的某些缺点，特别是由于对形成载体颗粒的病毒结构蛋白的体液和细胞免疫应答以及任何从头病毒基因表达所致的缺点。非病毒递送技术的优点之一是使用脂质纳米颗粒(lnp)作为载体。lnp提供了独特的机会，其允许将阳离子脂质设计为lnp组分，这可以规避与病毒基因疗法相关联的引起显著毒性的体液和细胞免疫应答。

4、阳离子脂质大致由阳离子胺部分、通常具有一个或两个脂族烃链的疏水结构域(即，疏水尾部，其可以是饱和的或不饱和的)、以及连接阳离子胺部分和疏水结构域的接头或可生物降解基团组成。阳离子胺部分和聚阴离子核酸静电相互作用以形成带正电荷的脂质体或脂质膜结构。因此，促进了到细胞中的摄取并且将核酸递送到细胞中。

5、一些广泛使用的阳离子脂质是clindma、dlindma(dodap)和dotap。这些脂质已用于核糖核酸(sirna或mrna)递送，但在较高剂量下具有次优的递送效率以及毒性。鉴于目前阳离子脂质的缺点，本领域需要提供不仅显示出增强的功效和降低的毒性，而且具有改善的药代动力学和细胞内动力学，诸如，细胞摄取和脂质载体的核酸释放的脂质支架。

技术实现思路

1、本公开中提供的阳离子脂质包含含有可生物降解基团的一个疏水尾部以及不含有可生物降解基团的疏水尾部。本公开中提供的一些示例性脂质包含在末端分叉以形成两个支链脂族烃链的疏水尾部和不分叉的疏水尾部。本发明人已经发现本公开的阳离子脂质可以以令人满意的产率和纯度合成。本发明人还已发现，当配制为用于携带治疗性核酸的脂质纳米颗粒(lnp)时，本公开的阳离子脂质提供了在核酸内的转基因插入物的持续优异且稳定的体内表达，并且是良好耐受的。此外，不希望受理论束缚，本发明人认为，在分叉疏水尾部中的末端支链脂族烃链的长度(即，碳原子的数量)、非分叉疏水尾部的长度以及可生物降解的基团与分叉疏水尾部之间的距离之间的微妙相互作用对于实现lnp组合物的优异包封效率、表达水平和体内耐受性尤其重要。

2、因此，在一个方面中，本文提供了由式i或ia表示的阳离子脂质：

3、

4、以及其药学上可接受的盐，其中r'、r1、r2、r3、r4、r5、r6a、r6b、x和n如本文分别对于式i或ia中的每一者所定义的。

5、还提供了药物组合物，该药物组合物包含本文所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。

6、本公开的另一方面涉及一种组合物，该组合物包含脂质纳米颗粒(lnp)和核酸，该脂质纳米颗粒(lnp)包含本文所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，核酸被包封在lnp中。在具体实施方案中，该核酸是末端封闭的dna(cedna)。

7、本公开的另一方面涉及一种使用本文所述的公开的阳离子脂质或组合物治疗受试者的基因病症的方法。

技术特征：

1.一种由式i表示的阳离子脂质：

2.根据权利要求1所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中x是-oc(＝o)-、-sc(＝o)-、-oc(＝s)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)s-或-s-s-。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的阳离子脂质，其中所述脂质由式ii表示：

4.根据权利要求1至3中任一项所述的阳离子脂质，其中所述脂质由式iii表示：

5.根据权利要求1至4中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r1和r2各自独立地为氢、c1-c2烷基、或c2-c3烯基。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r'、r1和r2各自独立地为氢或c1-c2烷基。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的阳离子脂质，其中所述脂质由式iv表示：

8.根据权利要求1至7中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r5不存在或为c1-c8亚烷基。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r5不存在或为c2亚烷基。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的阳离子脂质，其中所述脂质由式v表示：

11.根据权利要求1至10中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r4为c1-c14非支链烷基、c2-c14非支链烯基或

12.根据权利要求1至11中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r4为c2-c12非支链烷基或c2-c12非支链烯基。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r4为c5-c12非支链烷基。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r4为c6非支链烷基、c7非支链烷基、c8非支链烷基、c9非支链烷基、c10非支链烷基、c11非支链烷基或c12非支链烷基。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r4为c9非支链烷基。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r3为c3-c8亚烷基或c3-c8亚烯基。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r3为c3-c7亚烷基。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r3为c7亚烷基。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r3为c5亚烷基。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r6a和r6b各自独立地为c7-c12烷基或c7-c12烯基。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r6a和r6b各自独立地为c7烷基、c8烷基、c9烷基、c10烷基、c11烷基、c12烷基、c8烯基、c10烯基、c11烯基或c12烯基。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r6a和r6b各自独立地为c7烷基、c8烷基、c9烷基、c10烷基、c11烷基或c12烷基。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r6a和r6b含有彼此相等数量的碳原子。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r6a和r6b是相同的。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r6a和r6b两者均为c7烷基、或c8烷基、或c9烷基、或c10烷基、或c11烷基、或c12烷基。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r6a和r6b两者均为c8烷基。

27.根据权利要求1至25中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r6a和r6b两者均为c9烷基。

28.根据权利要求1至25中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r6a和r6b两者均为c10烷基。

29.根据权利要求1至25中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r6a和r6b两者均为c11烷基。

30.根据权利要求1至25中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r6a和r6b两者均为c12烷基。

31.根据权利要求1至22中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r6a和r6b各自含有彼此不同数量的碳原子。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中r'不存在。

33.根据权利要求1所述的阳离子脂质，其中所述脂质是：

34.一种脂质纳米颗粒(lnp)，所述脂质纳米颗粒包含根据权利要求1至33中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐；以及治疗性核酸。

35.根据权利要求34所述的脂质纳米颗粒，其中所述治疗性核酸被包封在所述脂质中。

36.根据权利要求34或权利要求35所述的脂质纳米颗粒，其中所述治疗性核酸选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)、反义寡核苷酸(aso)、核酶、cedna、迷你串、doggybonetm、末端经前端粒封闭的dna或哑铃状线性dna、切丁酶-底物dsrna、小发夹rna(shrna)、不对称干扰rna(airna)、微小rna(mirna)、mrna、trna、rrna、dna病毒载体、病毒rna载体、非病毒载体以及它们的任何组合。

37.根据权利要求34至36中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述治疗性核酸是末端封闭的dna(cedna)。

38.根据权利要求34至36中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒进一步包含固醇。

39.根据权利要求38所述的脂质纳米颗粒，其中所述固醇是胆固醇或β-谷固醇。

40.根据权利要求34至39中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒进一步包含非阳离子脂质。

41.根据权利要求40所述的脂质纳米颗粒，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺(dspe)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰基磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(dppg)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(dope-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆酰基磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰基磷脂酰-乙醇胺(dspe)、单甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-o-单甲基pe)、二甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-o-二甲基pe)、18-1-反式pe、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(sope)、氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、卵磷脂酰胆碱(epc)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(dops)、鞘磷脂(sm)、二肉豆酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、二肉豆酰基磷脂酰甘油(dmpg)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(dspg)、二芥酰基磷脂酰胆碱(depc)、棕榈酰基油酰磷脂酰甘油(popg)、二反式油酰基磷脂酰乙醇胺(depe)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dlpe)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dphype)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(esm)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷、磷酸二鲸蜡酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱以及它们的混合物。

42.根据权利要求40或权利要求41所述的脂质纳米颗粒，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)。

43.根据权利要求34至42中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒进一步包含至少一种聚乙二醇化脂质。

44.根据权利要求43所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少一种聚乙二醇化脂质选自由以下组成的组：peg-二月桂氧基丙基；peg-二肉豆蔻基氧基丙基；peg-二棕榈基氧基丙基、peg-二硬脂基氧基丙基；l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油-peg(dmg-peg)；二硬脂酰-外消旋-甘油-peg(dsg-peg)；

45.根据权利要求43或权利要求44所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少一种聚乙二醇化脂质是dmg-peg、dspe-peg、dspe-peg-oh、dsg-peg或它们的组合。

46.根据权利要求43至45中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少一种聚乙二醇化脂质是dmg-peg2000、dspe-peg2000、dspe-peg2000-oh、dsg-peg2000或它们的组合。

47.根据权利要求34至46中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒进一步包含组织特异性靶向配体。

48.根据权利要求47所述的脂质纳米颗粒，其中所述组织特异性靶向配体是n-乙酰半乳糖胺(galnac)或galnac衍生物。

49.根据权利要求47或权利要求48所述的脂质纳米颗粒，其中所述组织特异性靶向配体与所述至少一种聚乙二醇化脂质共价连接以形成聚乙二醇化脂质缀合物。

50.根据权利要求49所述的脂质纳米颗粒，其中所述聚乙二醇化脂质缀合物包含与dspe-peg2000共价连接的四触角galnac。

51.根据权利要求34至50中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述阳离子脂质以约30％至约80％的摩尔百分比存在。

52.根据权利要求38至51中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述固醇以约20％至约50％的摩尔百分比存在。

53.根据权利要求40至52中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述非阳离子脂质以约2％至约20％的摩尔百分比存在。

54.根据权利要求43至53中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少一种聚乙二醇化脂质以约2.1％至约10％的摩尔百分比存在。

55.根据权利要求49至54中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述聚乙二醇化脂质缀合物以约0.1％至约10％的摩尔百分比存在。

56.根据权利要求34所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒进一步包含固醇、非阳离子脂质、聚乙二醇化脂质和聚乙二醇化脂质缀合物。

57.根据权利要求34至56中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒进一步包含地塞米松棕榈酸酯。

58.根据权利要求34至57中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述颗粒的总脂质与cedna的比率为约10:1至约40:1。

59.根据权利要求34至58中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径范围为约40nm至约120nm。

60.根据权利要求34至59中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径小于约100nm。

61.根据权利要求34至60中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径为约60nm至约80nm。

62.根据权利要求34至61中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述cedna是末端封闭的线性双链体dna。

63.根据权利要求62所述的脂质纳米颗粒，其中所述cedna包含表达盒，并且其中所述表达盒包含启动子序列和转基因。

64.根据权利要求63所述的脂质纳米颗粒，其中所述表达盒包含聚腺苷酸化序列。

65.根据权利要求62至64中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述cedna包含至少一个反向末端重复序列(itr)，所述itr侧接于所述表达盒的5'或3'端。

66.根据权利要求65所述的脂质纳米颗粒，其中所述表达盒侧接两个itr，其中所述两个itr包括一个5'itr和一个3'itr。

67.根据权利要求65所述的脂质纳米颗粒，其中所述表达盒连接至3'端的itr(3'itr)。

68.根据权利要求65所述的脂质纳米颗粒，其中所述表达盒连接至5'端的itr(5'itr)。

69.根据权利要求65所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少一个itr是源自aav血清型的itr、源自鹅病毒的itr、源自b19病毒的itr、源自细小病毒的野生型itr。

70.根据权利要求69所述的脂质纳米颗粒，其中所述aav血清型选自由以下组成的组：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11和aav12。

71.根据权利要求66至70中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述5'itr和所述3'itr中的至少一者是野生型aav itr。

72.根据权利要求66至71中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述5'itr和所述3'itr中的至少一者是经修饰或突变的itr。

73.根据权利要求66至72中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述5'itr和所述3'itr是对称的。

74.根据权利要求66至73中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述5'itr和所述3'itr是不对称的。

75.根据权利要求66至74中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述cedna进一步包含在5'itr与所述表达盒之间的间隔序列。

76.根据权利要求66至75中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述cedna进一步包含在3'itr与所述表达盒之间的间隔序列。

77.根据权利要求75或权利要求76所述的脂质纳米颗粒，其中所述间隔序列的长度为至少5个碱基对长。

78.根据权利要求37至77中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述cedna具有切口或空位。

79.根据权利要求37至78中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述cedna是celid、基于dna的小环、midge、迷你串dna、在表达盒的5'端和3'端包含两个itr发夹结构的哑铃形线性双链体末端封闭的dna、或doggybonetmdna。

80.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至34中任一项所述的阳离子脂质或根据权利要求34至79中任一项所述的脂质纳米颗粒，以及药学上可接受的赋形剂。

81.一种治疗受试者的基因病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求34至79中任一项所述的脂质纳米颗粒，或有效量的根据权利要求80所述的药物组合物。

82.根据权利要求81所述的方法，其中所述受试者是人类。

83.根据权利要求81或权利要求82所述的方法，其中所述基因病症选自由以下组成的组：镰状细胞性贫血，黑色素瘤，血友病a(凝血因子viii(fviii)缺乏症)和血友病b(凝血因子ix(fix)缺乏症)，囊性纤维化(cftr)，家族性高胆固醇血症(ldl受体缺陷)，肝母细胞瘤，威尔逊病，苯丙酮尿症(pku)，先天性肝卟啉症，遗传性肝代谢疾病，lesch nyhan综合征，镰状细胞性贫血，地中海贫血，色素性干皮病，范可尼贫血，色素性视网膜炎，共济失调毛细血管扩张症，布鲁姆综合征，视网膜母细胞瘤，粘多糖贮积病(例如，hurler综合征(mps i型)，scheie综合征(mps i s型)，hurler-scheie综合征(mps i h-s型)，亨特综合征(mps ii型)，sanfilippo a、b、c和d型(mps iii a、b、c和d型)，morquio a和b型(mps iva和mpsivb)，maroteaux-lamy综合征(mps vi型)，sly综合征(mps vii型)，透明质酸酶缺乏症(mpsix型))，niemann-pick病a/b、c1和c2型，法布里病，schindler病，gm2-神经节苷脂沉积症ii型(sandhoff病)，tay-sachs病，异染性脑白质营养不良，krabbe病，粘脂沉积症i、ii/iii和iv型，唾液酸贮积症i和ii型，糖原贮积病i和ii型(庞贝病)，戈谢病i、ii和iii型，胱氨酸病，巴顿病，天冬氨酰氨基葡萄糖尿症，salla病，达农病(lamp-2缺乏症)，溶酶体酸性脂肪酶(lal)缺乏症，神经元蜡样脂褐质沉积症(cln1-8、incl和lincl)，鞘脂症，半乳糖唾液酸中毒，肌萎缩侧索硬化症(als)，帕金森病，阿尔茨海默病，亨廷顿病，脊髓小脑共济失调，脊髓性肌萎缩症，弗里德赖希共济失调，杜氏肌营养不良症(dmd)，贝克尔肌营养不良症(bmd)，营养不良性大疱性表皮松解症(deb)，外核苷酸焦磷酸酶1缺乏症，婴儿全身性动脉钙化(gaci)，利伯先天性黑矇(leber congenital amaurosis)，stargardt黄斑营养不良(abca4)，鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏症，usher综合征，年龄相关性黄斑变性(amd)，α-1抗胰蛋白酶缺乏症，进行性家族性肝内胆汁淤积症(pfic)i型(atp8b1缺乏症)、ii型(abcb11)、iii型(abcb4)或iv型(tjp2)和组织蛋白酶a缺乏症。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是血友病a。

85.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是血友病b。

86.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是苯丙酮尿症(pku)。

87.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是威尔逊病。

88.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是戈谢病i型、ii型或iii型。

89.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是stargardt黄斑营养不良。

90.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是lca10。

91.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是usher综合征。

92.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是湿性amd。

93.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是营养不良性大疱性表皮松解症(deb)。

技术总结
本文提供了具有式I或式Ia的阳离子脂质：或其药学上可接受的盐，其中R'、R1、R2、R3、R4、R5、R6a、R6b、X和n如本文所定义。本文还提供了脂质纳米颗粒(LNP)组合物，该LNP组合物包含具有式I或Ia的阳离子脂质和无衣壳非病毒载体(例如，ceDNA)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个方面，这些LNP可用于将无衣壳非病毒DNA载体递送至所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。

技术研发人员：M·G·斯坦顿,B·诺尔廷,A·米尔斯泰德
受保护的技术使用者：世代生物公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4