通过缀合的N-末端甘氨酸修饰的细胞及其用途的制作方法

本公开一般涉及修饰的细胞，更具体地涉及膜蛋白修饰的细胞及其用于递送物质的用途，所述物质包括药物和探针等。

背景技术：

1、近年来，用于延长在治疗多种人疾病中药物保留时间的药物递送系统的开发引起了广泛关注。然而，许多系统仍然面临各种挑战和限制，例如稳定性差、不想要的毒性和免疫反应[1]。红细胞(rbc)是人体内最常见的细胞类型，三十多年来作为理想的体内药物递送系统已被广泛研究，原因是其独特的生物学特性，包括：(i)循环范围广泛遍及全身；(ii)作为生物材料具有良好的生物相容性，体内存活时间长；(iii)大的表面积与体积比；(iv)没有细胞核、线粒体和其他细胞器。

2、通过直接封装、外源肽的非共价连接、或通过与红细胞表面蛋白特异性抗体的融合来安装蛋白质，红细胞已被开发为药物递送载体。已经证明这种修饰的rbc的体内应用存在局限性。例如，封装会破坏细胞膜，从而影响工程改造细胞的体内存活率。此外，聚合物颗粒与rbc的非共价连接容易解离，有效载荷将很快在体内降解。

3、细菌分选酶是能够以共价和位点特异性方式修饰蛋白的转肽酶[2]。来自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的野生型分选酶a(wt srta)识别lpxtg基序，并在苏氨酸和甘氨酸之间进行切割，在酶和底物蛋白之间形成共价酰基酶中间体。该中间体通过n-末端通常具有三个连续甘氨酸残基(3×甘氨酸，g3)的肽或蛋白质的亲核攻击来解离。先前的研究已经在rbc上基因过表达了kell膜蛋白，该膜蛋白在其c-末端具有lpxtg基序，通过使用wt srta，可以将其连接到3×甘氨酸或g(n≥3)修饰的蛋白质/肽的n-末端[3]。这些携带药物的rbc在动物模型中显示出治疗疾病的功效。然而，这需要工程改造造血干细胞或祖细胞(hspc)并将这些细胞分化为成熟rbc的步骤，这极大地限制了应用。

4、根据感兴趣的应用，使用hspc以外的细胞来递送治疗剂可能是有益的。

5、因此，本领域仍然需要改进的细胞递送系统。

技术实现思路

1、在第一方面，本公开提供了一种细胞，所述细胞具有与其连接的物质，其中所述物质通过分选酶识别基序与所述细胞的至少一种膜蛋白连接，并且与至少一种膜蛋白连接的所述细胞包含以下结构：a1-l1-glymxn-l2-p，其中a1代表物质，l1代表分选酶介导的反应后分选酶识别基序的残余部分，glym代表m个甘氨酸，其中m优选为1-5，xn代表n个间隔氨基酸，其中n优选为0-10，l2不存在或代表交联后第一双功能交联剂的残余部分，p代表细胞的至少一种膜蛋白。

2、在一些实施方案中，第一双功能交联剂是胺-巯基型，优选马来酰亚胺碳酸(c2-8),例如，6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸。

3、在一些实施方案中，第一双功能交联剂使所述侧链氨基与至少一种膜蛋白的至少一个暴露的巯基交联。

4、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列，或基本上由、或由选自以下的氨基酸序列组成：lpxtg、lpxag、lpxsg、lpxlg、lpxvg、lgxtg、laxtg、lsxtg、npxtg、mpxtg、ipxtg、spxtg、vpxtg、ypxrg、lpxts和lpxta，其中x是任何氨基酸。

5、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含位于分选酶识别基序的n-末端至c-末端方向第5位的非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是任选取代的羟基羧酸，其具有式ch2oh-(ch2)n-cooh，其中n为0至3的整数，优选n＝0。

6、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列，或基本上由、或由选自以下的氨基酸序列组成：lpxt*y、lpxa*y、lpxs*y、lpxl*y、lpxv*y、lgxt*y、laxt*y、lsxt*y、npxt*y、mpxt*y、ipxt*y、spxt*y、vpxt*y和ypxr*y，其中*表示任选取代的羟基羧酸，并且x和y独立地代表任何氨基酸。

7、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列，或基本上由、或由选自以下的氨基酸序列组成：lpxt*g、lpxa*g、lpxs*g、lpxl*g、lpxv*g、lgxt*g、laxt*g、lsxt*g、npxt*g、mpxt*g、ipxt*g、spxt*g、vpxt*g、ypxr*g、lpxt*s和lpxt*a，其中m优选为lpet*g，其中*为2-羟基乙酸。

8、在一些实施方案中，l1选自lpxt、lpxa、lpxs、lpxl、lpxv、lgxt、laxt、lsxt、npxt、mpxt、ipxt、spxt、vpxt和ypxr，其中x是任何氨基酸。

9、在一些实施方案中，物质a1与l1通过第二双功能交联剂连接，所述第二双功能交联剂优选选自以下类型：(1)零长度型；(2)胺-巯基型；(3)同双功能nhs酯型；(4)同双功能亚胺酯型；(5)羰基-巯基型；(6)巯基反应型；(7)巯基-羟基型；更优选地，所述第二双功能交联剂是马来酰亚胺碳酸(c2-8)，例如6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸，并且物质a1包含暴露的巯基，优选暴露的半胱氨酸，更优选末端半胱氨酸，并且最优选c-末端半胱氨酸。

10、在一些实施方案中，所述物质包括结合剂、治疗剂或检测剂，包括，例如蛋白质、肽(例如寡聚ace2的细胞外结构域)、抗体(例如抗pd1抗体或其功能性抗体片段)、抗原或表位(例如肿瘤抗原)、mhc-肽复合物、药物例如小分子药物(例如抗肿瘤剂，例如化疗剂)、酶(例如功能性代谢或治疗酶)例如黄曲霉(aspergillus flavus)尿酸酶、激素、细胞因子、生长因子、抗微生物剂、探针、配体、受体、免疫耐受诱导肽、靶向部分、前药或其任何组合。

11、在一些实施方案中，所述细胞包含a1-lpet-glymxn-l2-p的结构，优选地，所述a1选自pal(苯丙氨酸氨裂合酶)、hpv(例如hpv16-mhc1)、uox或pd1 mab，更优选地，glymxn-l2是gaask-mal。

12、在一些实施方案中，分选酶是分选酶a(srta)，例如，金黄色葡萄球菌转肽酶a，例如，金黄色葡萄球菌转肽酶a变体(mgsrta)。

13、在一些实施方案中，细胞选自由红细胞、t细胞、b细胞、单核细胞、nk细胞和巨核细胞。

14、在一些实施方案中，其中细胞是具有选自以下结构的红细胞：pal-lpet-gaask-mal-p、hpv-lpet-gaask-mal-p、hpv16-mhc1-lpet-gaask-mal-p、uox-lpet-gaask-mal-p或pd1mab-1-lpet-gaask-mal-p。

15、在第二方面，本发明提供了一种修饰细胞的方法，包括：

16、(i)提供具有式glymxn-l2’的肽，其中glym代表m个甘氨酸，m优选为1-5，并且xn代表n个间隔氨基酸，其中n优选为0-10，并且l2'代表第一双功能交联剂与glymxn连接后的残余部分；

17、(ii)在将glymxn-l2’肽连接至细胞的至少一种膜蛋白的条件下用glymxn-l2’肽处理细胞；和

18、(iii)在分选酶存在下，在适合于分选酶通过分选酶介导的反应将分选酶底物缀合至glym的一种或多种条件下，使处理的细胞与包含分选酶识别基序和物质的分选酶底物接触，

19、从而获得具有a1-l1-glymxn-l2-p结构的修饰的细胞，其中a1代表物质，l1代表分选酶介导的反应后分选酶识别基序的残余部分，p代表细胞的至少一种膜蛋白。

20、在一些实施方案中，在处理步骤之前，该方法还包括用还原剂预处理细胞以形成暴露的巯基的步骤。

21、在一些实施方案中，第一双功能交联剂是胺-巯基类型，优选马来酰亚胺碳酸(c2-8),例如，6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸。

22、在一些实施方案中，xn包含至少一个具有侧链氨基的氨基酸，例如赖氨酸，并且优选地xn的c-末端氨基酸是具有侧链氨基的氨基酸。

23、在一些实施方案中，第一交联剂使所述侧链氨基与至少一种膜蛋白的至少一个暴露的巯基交联。

24、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列，或基本上由、或由选自以下的氨基酸序列组成：lpxtg、lpxag、lpxsg、lpxlg、lpxvg、lgxtg、laxtg、lsxtg、npxtg、mpxtg、ipxtg、spxtg、vpxtg、ypxrg、lpxts和lpxta，其中x是任何氨基酸。

25、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含位于分选酶识别基序的n-末端至c-末端方向第5位的非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是任选取代的羟基羧酸，其具有式ch2oh-(ch2)n-cooh，其中n为0至3的整数，优选n＝0。

26、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列，或基本上由、或由选自以下的氨基酸序列组成：lpxt*y、lpxa*y、lpxs*y、lpxl*y、lpxv*y、lgxt*y、laxt*y、lsxt*y、npxt*y、mpxt*y、ipxt*y、spxt*y、vpxt*y和ypxr*y，其中*表示任选取代的羟基羧酸；并且x和y独立地代表任何氨基酸。

27、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含选自以下的氨基酸序列，或基本上由、或由选自以下的氨基酸序列组成：lpxt*g、lpxa*g、lpxs*g、lpxl*g、lpxv*g、lgxt*g、laxt*g、lsxt*g、npxt*g、mpxt*g、ipxt*g、spxt*g、vpxt*g、ypxr*g、lpxt*s和lpxt*a，其中m优选为lpet*g，其中*为2-羟基乙酸。

28、在一些实施方案中，物质a1与l1通过第二双功能交联剂连接，所述第二双功能交联剂优选选自以下类型：(1)零长度型；(2)胺-巯基型；(3)同双功能nhs酯型；(4)同双功能亚胺酯型；(5)羰基-巯基型；(6)巯基反应型；(7)巯基-羟基型；更优选地，所述第二双功能交联剂是马来酰亚胺碳酸(c2-8)，例如6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸，并且物质a1包含暴露的巯基，优选暴露的半胱氨酸，更优选末端半胱氨酸，并且最优选c-末端半胱氨酸。

29、在一些实施方案中，所述物质包括结合剂、治疗剂或检测剂，包括，例如蛋白质、肽(例如寡聚ace2的细胞外结构域)、抗体(例如抗pd1抗体或其功能性抗体片段)、抗原或表位(例如肿瘤抗原)、mhc-肽复合物、药物例如小分子药物(例如抗肿瘤剂，例如化疗剂)、酶(例如功能性代谢或治疗酶)例如黄曲霉(aspergillus flavus uricase)尿酸酶、激素、细胞因子、生长因子、抗微生物剂、探针、配体、受体、免疫耐受诱导肽、靶向部分、前药或其任何组合。

30、在一些实施方案中，分选酶是分选酶a(srta)，例如，金黄色葡萄球菌转肽酶a，例如，金黄色葡萄球菌转肽酶a变体(mgsrta)。

31、在一些实施方案中，修饰的细胞包含a1-lpet-glymxn-l2-p的结构，优选地，所述a1选自pal(苯丙氨酸氨裂合酶)、hpv(例如hpv16-mhc1)、uox或pd1 mab，更优选地，glymxn-l2是gaask-mal。

32、在一些实施方案中，细胞选自由红细胞、t细胞、b细胞、单核细胞、nk细胞和巨核细胞。

33、在一些实施方案中，其中修饰的细胞是具有选自以下结构的红细胞：pal-lpet-gaask-mal-p、hpv-lpet-gaask-mal-p、hpv16-mhc1-lpet-gaask-mal-p、uox-lpet-gaask-mal-p或pd1mab-1-lpet-gaask-mal-p。

34、在第三方面，本公开提供了通过第二方面的方法获得的细胞。

35、在第四方面，本公开提供了包含第一和/或第三方面的细胞和任选的生理学上可接受的载体的组合物。

36、在第五方面，本公开提供了用于在有需要的受试者中诊断、治疗或预防病症、适应症或疾病的方法，包括向受试者施用第一和/或第三方面的细胞或第四方面的组合物。

37、在一些实施方案中，病症、适应症或疾病选自肿瘤或癌症(例如宫颈癌)、代谢疾病(例如溶酶体贮积障碍(lsd))、细菌感染、病毒感染(例如冠状病毒感染，例如sars-cov或sars-cov-2感染)、自身免疫性疾病和炎性疾病。

38、在第六方面，本公开提供了将物质递送至有需要的受试者的方法，包括向受试者施用第一和/或第三方面的细胞或第四方面的组合物。

39、在第七方面，本公开提供了一种增加受试者中物质的循环时间或血浆半衰期的方法，包括根据第二方面的方法将物质与细胞连接。

40、在第八方面，本发明提供了第一和/或第三方面的细胞或第四方面的组合物在制备用于诊断、治疗或预防病症、适应症或疾病的药物中的用途、或在制备用于诊断病症、适应症或疾病的诊断剂中的用途、或用于递送物质的用途。

41、在一些实施方案中，病症、适应症或疾病选自肿瘤或癌症(例如宫颈癌)、代谢疾病(例如溶酶体贮积障碍(lsd))、细菌感染、病毒感染(例如冠状病毒感染，例如sars-cov或sars-cov-2感染)、自身免疫性疾病和炎性疾病。

42、在一些实施方案中，药物是疫苗。

43、在第九方面，提供第一和/或第三方面的细胞或第四方面的组合物用于在有需要的受试者中诊断、治疗或预防病症、适应症或疾病。

44、在一些实施方案中，病症、适应症或疾病选自肿瘤或癌症(例如宫颈癌)、代谢疾病(例如溶酶体贮积障碍(lsd))、细菌感染、病毒感染(例如冠状病毒感染，例如sars-cov或sars-cov-2感染)、自身免疫性疾病和炎性疾病。