肺泡类器官及其制备和使用方法与流程

本发明总体上涉及肺泡类器官、制备和使用方法。

背景技术：

1、人类呼吸道覆盖有两种不同类型的上皮，近端气道上皮和远端肺泡上皮(图1a)。前者排列在从鼻腔至终末细支气管的气道上，由四种主要类型的上皮细胞组成，即纤毛细胞、杯状细胞、棒状细胞和基底细胞。人肺泡囊(通气和氧交换的基本单位)覆盖有肺泡上皮，由扁平的i型肺泡上皮(at1)细胞和立方形的ii型肺泡上皮(at2)细胞组成。人呼吸道上皮细胞不能在体外长期稳定地维持和扩增。目前，永生化细胞系例如人肺腺癌细胞系a549或calu3已常用于研究呼吸系统疾病，包括sars-cov-2的呼吸道感染。然而，这些同质细胞系无法模拟人呼吸道上皮的多细胞复杂性和功能多样性，更不用说模拟和研究人类生物学和病理学。原代人肺泡上皮细胞可商购。然而，它们不可扩增且非常昂贵，因为它们很可能是从捐赠尸体的肺组织中获取的，这阻碍了这些原代材料在常规研究中的应用。

2、原代呼吸道上皮细胞的缺乏严重阻碍了呼吸道疾病包括大流行的covid-19的研究。

3、因此，本发明的目的是提供制备肺泡类器官的方法。

4、本发明的另一个目的是提供用于制备肺泡类器官的组合物。

5、本发明的又一个目的是提供体外衍生的肺泡类器官。

技术实现思路

0、发明概述

1、提供了获得分化的肺泡细胞群的方法、通过所公开的方法生成的分化的肺泡细胞以及分化的肺泡细胞的用途。分化的肺泡细胞群呈类器官的形式，本文为肺泡类器官(alvo)。

2、这些方法包括将长期可扩增的肺类器官(lo)消化成单细胞(即解离的细胞)，在远端分化(dd)细胞培养基中培养解离的细胞，然后在具有远端分化培养基的非贴壁板中进行悬浮培养有效时间，优选地，至少两周，随后获得具有生理活性的肺泡类器官。长期可扩增的肺类器官优选从受试者的肺组织样品中获得。

3、还公开了肺泡类器官，其中包括at1和at2细胞群，如典型的at1细胞标志物aqp5(水通道蛋白5)、hopx(同源域特有蛋白同源框)和at2细胞标志物sftpa(肺表面活性剂相关蛋白a)、sftpb(肺表面活性剂相关蛋白b)、sftpc(肺表面活性剂相关蛋白c)、sftpd(肺表面活性剂相关蛋白d)的表达所证明的。悬浮培养中的肺泡类器官表现出顶端向外的极性，并包括丰富的细胞质板层小体和微绒毛。

4、所公开的肺泡类器官可以单独使用或与2d和3d awo(图3)组合使用，以在培养板中重建人类呼吸道上皮，用于研究人类呼吸系统的生物学和病理学，包括但不限于，由sars冠状病毒2引起的covid-19呼吸道疾病的研究。

技术特征：

1.生成肺泡类器官(alvo)的方法，所述方法包括将肺类器官(lo)在远端分化培养基中培养足以生成alvo的时段，所述alvo包含由至少40％的i型肺泡上皮(at1)细胞和ii型肺泡上皮(at2)细胞组成的细胞群，其中所述at1细胞是aqp5+，并且所述at2细胞是sftpc+；

2.权利要求1所述的方法，其中所述wnt激动剂是wnt3。

3.权利要求2所述的方法，其中所述wnt3的浓度为约25-60％v/v；优选30-55％，例如30、40、45、50、55％v/v。

4.权利要求3所述的方法，其中ibmx以约50μm至约500μm之间、优选约75μm至250μm之间、更优选90μm至150μm之间、例如约95μm、约100μm、约105μm、约110μm的浓度使用。

5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中(a)8-溴代环amp的浓度为约50μm至约500μm之间，优选约75μm至250μm之间，更优选90μm至150μm之间，例如约95μm、约100μm、约105μm、约110μm；和/或(b)地塞米松以约25nm至150nm之间，优选40nm至约100nm之间，并且更优选约45nm至60nm之间，例如约50nm或约55nm的浓度使用。

6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中在dd培养基中培养所述lo之前，所述方法进一步包括以下步骤的一个或多个：

7.权利要求6所述的方法，其中所述lo形成阶段包括在包含表1中列出的一个或多个组分的扩增培养基中培养细胞，任选的浓度如表1所示。

8.权利要求7所述的方法，其中所述扩增培养基包含至少r-spondin、bmp抑制剂、tgf-β抑制剂、fgf和调蛋白β-1。

9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中培养所述肺细胞和/或lo的所述步骤包括培养与外源细胞外基质接触的细胞。

10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述lo是3d类器官。

11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述alvo是3d类器官。

12.根据权利要求1至11中任一项生成alvo的方法，所述方法包括以下步骤：

13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中每隔一天更新一次所述培养基。

14.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述类器官或细胞是人类器官或人细胞。

15.通过权利要求1至14中任一项的方法获得的alvo，其中所述alvo包含由至少40％的i型肺泡上皮(at1)细胞和ii型肺泡上皮(at2)细胞组成的细胞群，其中所述at1细胞是aqp5+，并且所述at2细胞是sftpc+。

16.权利要求15所述的alvo，其中与从中获得它们的lo相比，所述alvo在at1细胞标志物aqp5或hopx和/或选自sftpa、sftpb、sftpc和sftpd的at2细胞标志物中具有至少2倍或至少3倍的上调。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的alvo，其中悬浮培养物中的所述alvo表现出顶端向外极性，如aqp5和htii-280的表达所证明的。

18.根据权利要求16-17中任一项所述的alvo，其中使用用gapdh归一化的mrna转录物的定量pcr来评估基因表达。

19.权利要求15-18中任一项所述的alvo，其中所述alvo还包含测试病毒。

20.在alvo中接触病毒的方法，所述方法包括：

21.权利要求20所述的方法，其中所述感染步骤还包括孵育至少30分钟、至少60分钟、至少90分钟或至少120分钟。

22.权利要求21所述的方法，其中所述孵育步骤在约37℃下进行。

23.预测测试病毒对人类的感染性的方法，所述方法包括：

24.权利要求23所述的方法，其中测试所述病毒滴度涉及检测病毒滴度的变化。

25.权利要求24所述的方法，其中病毒滴度的增加表示所述流感病毒对人类的可能感染性和/或其中在更短的时段内更大的增加与更高程度的感染性相关。

26.权利要求25所述的方法，其中在24小时内所述病毒滴度的增加为至少1log10单位、至少2log10单位、或至少3log10单位。

技术总结
提供了获得分化的肺泡细胞群的方法、通过该方法生成的肺泡类器官形式的分化的肺泡细胞以及分化的肺泡类器官的用途。这些方法包括将长期可扩增的肺类器官(LO)消化成单细胞(即解离的细胞)，并将解离的细胞在非贴壁板中的远端分化(DD)细胞培养基中悬浮培养有效时间。肺泡类器官包括AT1和AT2细胞群，在悬浮培养中表现出顶端向外的极性，并包括丰富的细胞质板层小体和微绒毛。该肺泡类器官可以单独使用或与2D和2D AWO组合使用，在培养板中重建人类呼吸道上皮，用于研究人类呼吸系统的生物学和病理学，包括但不限于COVID‑19呼吸道疾病的研究。

技术研发人员：周婕,赵文俊,李存,袁国勇
受保护的技术使用者：港大科桥有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/27