RETGC基因疗法的制作方法

发明领域本公开总体上涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本公开提供了用于治疗视网膜疾病的基因疗法的组合物和方法。

背景技术：

1、视网膜鸟苷酸环化酶(retgc)位于光感受器外节的圆盘膜中，并且是光感受器生理学中的关键酶之一，在哺乳动物视杆和视锥中产生光转导的第二信使环状单磷酸鸟苷(cgmp)。在光感受器激发和恢复过程中，两种retgc同工酶retgc1和retgc2(也分别称为gc-e和gc-f或rosgc1和rosgc2)受到通过鸟苷酸环化酶激活蛋白(gcap)介导的钙反馈的严格调控。

2、编码retgc的基因gucy2d中超过100个突变已知导致两种主要疾病：常染色体隐性莱伯氏先天性黑朦1型(arlca或lca1)或常染色体显性视锥视杆营养不良(adcrd)。在crd中，变性始于视锥细胞，并且由于未受影响的视网膜黄斑中高度存在视锥细胞而导致中心视野丧失。当视杆细胞变性跟着视锥细胞变性时，crd可导致完全失明。lca1表型显得甚至更加严重，在生命早期出现光感受器功能丧失和失明。

3、因此，迫切需要用于治疗与gucy2d突变相关的视网膜疾病(包括但不限于lca1和crd)的新疗法。

技术实现思路

1、在一方面，本公开提供了一种表达构建体，所述表达构建体包含：(a)赋予在感光细胞中表达的启动子序列，和(b)编码视网膜鸟苷酸环化酶1(retgc1)的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至启动子。

2、在一个实施方案中，启动子序列是视紫红质激酶(rk)或巨细胞病毒(cmv)启动子序列。

3、在一个实施方案中，启动子序列包含与seq id no:7至少90％同一的序列。在一个实施方案中，启动子序列包含seq id no:7。

4、在一个实施方案中，启动子序列包含与seq id no:8至少90％同一的序列。在一个实施方案中，启动子序列包含seq id no:8。

5、在一个实施方案中，表达构建体还包含转录后调控元件。在一个实施方案中，转录后调控包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。在一个实施方案中，转录后调控元件包含与seq id no:10至少90％同一的序列。在一个实施方案中，转录后调控元件包含seqid no:10。

6、在一个实施方案中，编码retgc1的核酸序列是来自野生型retgc1(gucy2d)基因的编码序列(cds)。在一个实施方案中，编码retgc1的核酸序列是密码子优化的序列。在一些实施方案中，编码retgc1的核酸序列包含与seq id no:9至少90％同一的序列。在一些实施方案中，编码retgc1的核酸序列包含seq id no:9。在一些实施方案中，编码retgc1的核酸序列包含与seq id no:13至少90％同一的序列。在一些实施方案中，编码retgc1的核酸序列包含seq id no:13。在一些实施方案中，编码retgc1的核酸序列包含与seq id no:14至少90％同一的序列。在一些实施方案中，编码retgc1的核酸序列包含seq id no:14。在一些实施方案中，编码retgc1的核酸序列编码蛋白质，所述蛋白质包含与seq id no:12至少90％同一的序列。在一些实施方案中，编码retgc1的核酸序列编码包含seq id no:12的蛋白质。

7、在一个实施方案中，表达构建体还包含聚腺苷酸化信号。在实施方案中，聚腺苷酸化信号包含牛生长激素聚腺苷酸化(bgh-polya)信号。在一个实施方案中，聚腺苷酸化信号包含与seq id no:11至少90％同一的序列。在一个实施方案中，聚腺苷酸化信号包含seqid no:11。

8、在一些实施方案中，表达构建体包含与选自由seq id no:1-4组成的组的序列至少90％同一的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含选自由seq id no:1-4组成的组的序列。

9、在一方面，提供了一种包含本文公开的表达构建体的载体。在实施方案中，载体是病毒载体。在一个实施方案中，载体是腺相关病毒(aav)载体。在一个实施方案中，载体包含源自aav血清型aav2的基因组。在一个实施方案中，载体包含源自aav7m8的衣壳。

10、在一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的载体和药学上可接受的载剂(carrier)。

11、在一方面，提供了一种用于治疗有需要的受试者的视网膜疾病的方法，其中所述视网膜疾病与gucy2d基因中的一个或多个突变相关，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的载体或药物组合物。在一些实施方案中，视网膜疾病是视锥视杆营养不良(crd)或莱伯氏先天性黑朦1型(lca1)。在一个实施方案中，视网膜疾病是lca1。

12、在一方面，提供了一种增加有需要的受试者中视杆cgmp特异性3',5'-环状磷酸二酯酶亚基β(pde6β)表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的载体或药物组合物。

13、在一方面，提供了一种增加有需要的受试者的光感受器中的环状单磷酸鸟苷(cgmp)水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的载体或药物组合物。

14、在实施方案中，载体或药物组合物是通过眼内注射施用。在实施方案中，载体或药物组合物被注射到受试者的中央视网膜中。

技术特征：

1.一种表达构建体，所述表达构建体包含：

2.如权利要求1所述的表达构建体，其中所述启动子序列是视紫红质激酶(rk)或巨细胞病毒(cmv)启动子序列。

3.如权利要求2所述的表达构建体，其中所述启动子序列包含与seq id no:7至少90％同一的序列。

4.如权利要求3所述的表达构建体，其中所述启动子序列包含seq id no:7。

5.如权利要求2所述的表达构建体，其中所述启动子序列包含与seq id no:8至少90％同一的序列。

6.如权利要求5所述的表达构建体，其中所述启动子序列包含seq id no:8。

7.如前述权利要求中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体还包含转录后调控元件。

8.如权利要求7所述的表达构建体，其中所述转录后调控元件包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。

9.如权利要求7所述的表达构建体，其中所述转录后调控元件包含与seq id no:10至少90％同一的序列。

10.如权利要求9所述的表达构建体，其中所述转录后调控元件包含seq id no:10。

11.如权利要求1-10中任一项所述的表达构建体，其中编码所述retgc1的所述核酸序列是野生型retgc1基因。

12.如权利要求1-10中任一项所述的表达构建体，其中编码所述retgc1的所述核酸序列是密码子优化的序列。

13.如权利要求1-10中任一项所述的表达构建体，其中编码所述retgc1的所述核酸序列包含与seq id no:9、seq id no:13或seq id no:14至少90％同一的序列。

14.如权利要求13所述的表达构建体，其中编码所述retgc1的所述核酸序列包含seqid no:9、seq id no:13或seq id no:14。

15.如权利要求1-10中任一项所述的表达构建体，其中编码所述retgc1的所述核酸序列编码蛋白质，所述蛋白质包含与seq id no:12至少90％同一的序列。

16.如权利要求15所述的表达构建体，其中编码所述retgc1的所述核酸序列编码包含seq id no:12的蛋白质。

17.如前述权利要求中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体还包含聚腺苷酸化信号。

18.如权利要求17所述的表达构建体，其中所述聚腺苷酸化信号包含牛生长激素聚腺苷酸化(bgh-polya)信号。

19.如权利要求17所述的表达构建体，其中所述聚腺苷酸化信号包含与seq id no:11至少90％同一的序列。

20.如权利要求19所述的表达构建体，其中所述聚腺苷酸化信号包含seq id no:11。

21.如前述权利要求中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含与选自由seq id no:1-4组成的组的序列至少90％同一的序列。

22.如权利要求21所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含选自由seq id no:1-4组成的组的序列。

23.一种载体，所述载体包含如前述权利要求中任一项所述的表达构建体。

24.如权利要求23所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

25.如权利要求24所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(aav)载体。

26.如权利要求25所述的载体，其中所述载体包含源自aav血清型aav2的基因组。

27.如权利要求25或26中任一项所述的载体，其中所述载体包含源自aav7m8的衣壳。

28.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求23-27中任一项所述的载体和药学上可接受的载剂。

29.一种用于治疗有需要的受试者的视网膜疾病的方法，其中所述视网膜疾病与gucy2d基因中的一个或多个突变相关，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求23-27中任一项所述的载体或如权利要求28所述的药物组合物。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述视网膜疾病是视锥视杆营养不良(crd)或莱伯氏先天性黑朦1型(lca1)。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述视网膜疾病是lca1。

32.一种增加有需要的受试者中视杆cgmp特异性3',5'-环状磷酸二酯酶亚基β(pde6β)表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求23-27中任一项所述的载体或如权利要求28所述的药物组合物。

33.一种增加有需要的受试者的光感受器中的环状单磷酸鸟苷(cgmp)水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求23-27中任一项所述的载体或如权利要求28所述的药物组合物。

34.如权利要求29-33中任一项所述的方法，其中所述载体或所述药物组合物是通过眼内注射施用。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述载体或所述药物组合物被注射到所述受试者的中央视网膜中。

技术总结
本文提供了用于表达视网膜鸟苷酸环化酶1(RetGC1)的表达构建体、病毒基因组和载体，以及包含本文公开的载体的药物组合物。还提供了使用本文公开的表达构建体和载体的方法，包括治疗有需要的受试者的视网膜疾病的方法，其中所述视网膜疾病与GUCY2D基因中的一个或多个突变相关，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的载体。

技术研发人员：A·乔治亚迪斯
受保护的技术使用者：梅里特斯英国第二有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/8