从多能干细胞生产免疫细胞群的方法与流程

本发明涉及一种生产免疫细胞群的方法、通过本发明的方法可获得或获得的免疫细胞群、通过本发明的方法可获得或获得的非免疫原性t细胞、包含本发明的免疫细胞或非免疫原性t细胞的药物组合物，以及涉及所述免疫细胞群、非免疫原性t细胞或药物组合物用于治疗的方法中或用于细胞疗法中。

背景技术：

1、开发用于诊断和治疗的免疫细胞群，特别是t细胞群是当前的任务。为了能够提供这样的免疫细胞群(比如分化的t细胞群)，干细胞是良好的来源。干细胞的关键特征是它们能够无限地自我更新并分化为多种不同类型的细胞或组织。干细胞的自我更新能力对于它们作为原始未分化细胞库的特征是至关重要的。此外，干细胞的高“柔性”和“可塑性”特征建立在它们转分化为可能不同于它们来源的组织的能力上。多能干细胞(psc)作为产生t细胞的来源而备受关注。特别地，诱导多能干细胞(ips)是一种有用的来源，其代表可重编程为多能干细胞的非胚胎细胞。目前，最常用的多能细胞是胚胎干细胞(esc)或诱导多能干细胞(ipsc)。人esc系首先由thomson及其同事建立(thomson等，(1998),science 282:1145-1147)。最近，人esc研究使得开发一种将机体细胞重编程为es样细胞的新技术成为可能。该技术由yamanaka及其同事在2006年开创(takahashi&yamanaka(2006),cell,126:663-676)。所得到的诱导多能干细胞(ipsc)显示出与esc非常相似的行为，并且重要的是，它们还能够分化成身体的每种细胞。此外，据报道，孤雌生殖干细胞也适合于小鼠模型中的ehm生产(didié等，(2013),j clin invest.,123:1285-1298)。例如，wang等，naturebiomedical engineering,vol.5,may 2021,429-440描述了从遗传工程化的异源人诱导多能干细胞产生低免疫原性t细胞。单独工程化的t细胞是用于需要定向免疫应答的疾病(如癌症)的靶向治疗的有力工具。已经显示可以将t细胞体外培养和增殖，以用于过继性细胞免疫疗法或癌症疗法中，其中已经证实这种t细胞在肿瘤患者中具有抗肿瘤活性。

2、用于生产源自psc的t细胞的方法是本领域已知的，参见wang等，2021，见上文。此外，montel-hagen等(montel-hagen等，2019,cell stem cell24,376–389,2019年3月7日)公开了一种从多能干细胞生产t细胞的方法。根据该公开，通过在气液界面环境中培养细胞聚集体来实现免疫细胞分化。因此，montel-hagen描述的方法包括从psc产生t细胞的复杂且耗时的细胞培养技术。此外，iriguchi等(iriguchi等，2021,nature communications,12:430jan 18；12(1):430.doi:10.1038/s41467-020-20658-3)等公开了一种从ipsc生产t细胞的方法。iriguchi等描述了一种方法，该方法预测了在添加其它因子的涂覆dll4的平板上的t细胞分化。这种方法需要一定的细胞培养能力，这使得该方法难以产生更高数量的分化t细胞。这些方法的缺点是这些方法相当费力并且不适合以经济高效的方式生产免疫细胞。此外，这些现有技术方法仅允许生产t细胞。

3、因此，需要提供一种方法，该方法允许产生免疫细胞群，比如t细胞样细胞，但理想地还包含nk细胞样细胞。该方法还应该适于以大规模方法(例如在生物反应器中)进行，从而以有效的方式实现期望免疫细胞的更大收率。

4、因此，本发明的目的是提供这种满足所述需求的用于生产免疫细胞群的方法。上述目的通过独立权利要求的主题，特别是通过用于生产免疫细胞群的方法、通过所述方法可获得或获得的免疫细胞群、通过所述方法可获得或获得的t细胞、药物组合物以及用于治疗方法中的免疫细胞群来解决。提供如本文所述的免疫细胞群具有额外的优点，即可以根据所需应用选择性生产免疫细胞群的不同亚群，特别是t细胞样细胞和/或nk细胞样细胞。

技术实现思路

1、本发明的第一方面涉及一种从多能干细胞(psc)生产免疫细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：(i)通过以下步骤诱导3d细胞聚集体形成和造血分化(a)在无血清培养基中，在适于形成3d细胞聚集体的固体支持物上，在notch-配体delta-样配体4(dll4)信号传导活性的存在下，在合适的条件下培养已经经历间充质分化的psc，从而允许形成3d细胞聚集体；(b)收集所述3d细胞聚集体并在无血清培养基中以悬浮培养在合适的条件下培养约3至6天；以及(c)在无血清培养基中在合适的条件下将所述3d细胞聚集体培养约另外的4至7天；(ii)通过在无血清培养基中、以悬浮培养在合适的条件下培养(i)的所述3d细胞聚集体达合适的时间来诱导免疫细胞分化；从而提供免疫细胞群。

2、本发明的第二方面涉及一种通过本发明的方法可获得的免疫细胞群。

3、本发明的第三方面涉及一种通过本发明的方法获得的免疫细胞群。

4、本发明的第四方面涉及一种通过本发明的方法可获得的非免疫原性t细胞。

5、本发明的第五方面涉及一种通过本发明的方法获得的非免疫原性t细胞。

6、本发明的第六方面涉及一种通过本发明的方法可获得的非免疫原性t细胞，其中所述t细胞缺乏在t细胞的细胞表面上呈递(present)的内源性mhc i类分子，并且所述t细胞在其表面上包含免疫调节蛋白。

7、本发明的第七方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的免疫细胞群或本发明的非免疫原性t细胞。

8、本发明的第八方面涉及本发明的免疫细胞群、本发明的非免疫原性t细胞或本发明的药物组合物，其用于治疗方法中。

9、最后，本发明的第九方面涉及本发明的免疫细胞群、本发明的非免疫原性t细胞或本发明的药物组合物，其用于细胞疗法中。

技术特征：

1.一种从多能干细胞(psc)生产免疫细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(i)之前，进行另外的步骤(0i)，包括：

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述无血清培养基包含：

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述rock抑制剂是y-27632二盐酸盐，和所述alk受体抑制剂是sb43152。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)和(ii)中的所述悬浮培养是动态悬浮培养，优选通过以约60至80rpm的旋转在诸如轨道振荡器的振荡器上培养。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(ii)进行约21至50天。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述psc是人诱导多能干(ips)细胞，优选为人ips细胞系tc-1133。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述psc是多能干细胞，所述多能干细胞缺乏在所述多能干细胞的细胞表面上呈递的内源性mhc i类分子并且在其表面上包含免疫调节蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫调节蛋白是单链融合hla i类蛋白。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述单链融合hla i类蛋白包含与至少部分hla i类α链共价连接的至少部分b2m，所述hla i类α链选自hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞进一步表达由所述多能干细胞表面上的单链融合hla i类蛋白呈递的靶肽抗原。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述靶肽抗原共价连接至所述单链融合hla i类蛋白。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述靶肽抗原包含序列vmaprtlfl(seq idno:1)。

14.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，其中在所述多能干细胞中的β-微球蛋白2基因的基本上所有拷贝都被破坏。

15.根据权利要求8至14中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞选自胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和孤雌生殖干细胞。

16.根据权利要求8至15中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是灵长类动物来源的多能干细胞，优选为人多能干细胞。

17.根据权利要求8至16中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞由自脐带血分离的cd34-阳性细胞产生。

18.根据权利要求8至17中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是ninds人类细胞和数据库的nd-50039。

19.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述psc为缺乏内源性mhc ii类的多能干细胞。

20.根据权利要求19所述的方法，其中通过破坏c2ta基因-mhc ii类反式激活蛋白而使所述psc缺乏内源性mhc ii类。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，通过将psc与表达dll4的基质细胞共培养，或通过将psc与涂覆dll4的珠子一起温育来提供notch-配体delta样配体4(dll4)信号传导活性。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中psc与基质细胞的比率在约1:5至1:40的范围内。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述基质细胞是骨髓衍生的小鼠基质细胞系ms5。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述基质细胞是由表达dll4的psc分化的基质细胞。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将在步骤(0i)中的中胚层分化诱导期间的psc在包含至少一种细胞外基质蛋白的细胞培养容器中培养。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述容器涂覆了所述至少一种细胞外基质蛋白。

27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述至少一种细胞外基质蛋白选自玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、基质胶、含有氨基酸序列rgd的肽、含有氨基酸序列rgd的蛋白及它们的组合。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)(a)中，所述固体支持物包含一个或多个孔，其中每个孔包含v形或锥形空腔。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述固体支持物是微孔培养板。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述微孔培养板是aggrewelltm板(获自stemcelltechnologies)、biofloattm96-孔板(获自facellitate)或nunclon sphera 3d培养(获自thermofisher)。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之后分离所述3d细胞聚集体，从而提供单个细胞。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞群包含t细胞样细胞和nk细胞样细胞。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之后，进行另外的步骤(iii)，所述另外的步骤(iii)包括诱导，并且优选地还选择性扩增和活化t细胞样细胞和nk细胞样细胞。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，在合适的条件下诱导、选择性扩增和活化t细胞样细胞。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，在包含b27补充剂、scf、flt-3l、il-7、il-2、il-15和cd3刺激性结合分子的培养基中选择性扩增t细胞样细胞。

36.根据权利要求35所述的方法，其中步骤(iii)中的所述培养基包含约1至3％的b27补充剂、约5至15ng/ml scf、约2至7ng/ml flt-l3、约5至15ng/ml il-7、约5至15ng/ml il-2、约5至15ng/ml il-15，并且其中所述cd3刺激性结合分子选自抗-cd3抗体，比如okt-3抗体，优选地浓度为约250至750ng/ml，以及携带okt-3fab片段的多聚化试剂。

37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)之后进行另外的步骤(iv)，所述另外的步骤(iv)包括通过在包含b27补充剂和il-2的无血清培养基中在合适的条件下培养所述免疫细胞来进一步扩增。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(iv)的无血清培养基包含1至3％b27补充剂和30至70单位/ml il-2。

39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞群的特征在于cd4、cd8、cd56、cd3和cd45的表达。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法适于通过在步骤(ii)、(iii)和/或(iv)中的任一个或全部步骤中使用生物反应器条件来生产具有高细胞数量的免疫细胞群。

41.一种免疫细胞群，其通过权利要求1至40中任一项所述的方法可获得。

42.一种通过权利要求1至40中任一项所述的方法获得的免疫细胞群。

43.一种非免疫原性t细胞，其通过权利要求1至40中任一项所述的方法可获得。

44.一种通过权利要求1至40中任一项所述的方法获得的非免疫原性t细胞。

45.一种通过权利要求1至40中任一项所述的方法可获得的非免疫原性t细胞，其中所述t细胞缺乏在所述t细胞的细胞表面上呈递的内源性mhc i类分子并且所述t细胞在其表面上包含免疫调节蛋白。

46.根据权利要求45所述的非免疫原性t细胞，其中所述非免疫原性t细胞在其表面上表达嵌合抗原受体(car)或外源性t细胞受体(tcr)。

47.根据权利要求45或46所述的非免疫原性t细胞，其中在t细胞中所述β-微球蛋白2基因的基本上所有拷贝都被破坏，从而使所述t细胞在细胞表面上缺乏内源性mhc i类分子。

48.根据权利要求45至47中任一项所述的非免疫原性t细胞，其中所述免疫调节蛋白是单链融合hla i类蛋白。

49.根据权利要求48所述的非免疫原性t细胞，其中所述单链融合hla i类蛋白包含与至少部分hla i类α链共价连接的至少部分b2m，所述hla i类α链选自hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g。

50.根据权利要求48或49所述的非免疫原性t细胞，其中，所述单链融合hla i类蛋白包含至少部分b2m和至少部分hla-a。

51.根据权利要求45至50中任一项所述的非免疫原性t细胞，其中所述单链融合hla i类蛋白包含至少部分b2m和至少部分hla-a0201。

52.根据权利要求48或49所述的非免疫原性t细胞，其中所述单链融合hla i类蛋白包含至少部分b2m和至少部分hla-e。

53.根据权利要求48或49所述的非免疫原性t细胞，其中所述单链融合hla i类蛋白包含至少部分b2m和至少部分hla-g。

54.根据权利要求48或49所述的非免疫原性t细胞，其中所述单链融合hla i类蛋白包含至少部分b2m和至少部分hla-b。

55.根据权利要求48或49所述的非免疫原性t细胞，其中所述单链融合hla i类蛋白包含至少部分b2m和至少部分hla-c。

56.根据权利要求48或49所述的非免疫原性t细胞，其中所述单链融合hla i类蛋白包含至少部分b2m和至少部分hla-f。

57.根据权利要求45至56中任一项所述的非免疫原性t细胞，其中所述非免疫原性t细胞进一步表达由所述多能细胞表面上的单链融合hla i类蛋白呈递的靶肽抗原。

58.根据权利要求57所述的非免疫原性t细胞，其中所述靶肽抗原共价连接至所述单链融合hla i类蛋白。

59.根据权利要求57或58所述的非免疫原性t细胞，其中所述靶肽抗原包含序列vmaprtlfl(seq id no:1)。

60.根据权利要求45至59中任一项所述的非免疫原性t细胞，其中将所述免疫调节蛋白的基因整合到所述t细胞基因组的(内源性)b2m基因座中。

61.根据权利要求45至60中任一项的非免疫原性t细胞，其中将所述car或所述外源性tcr整合到内源tcr-α基因中、整合到内源tcr-β基因中或整合到内源tcr-α基因和内源tcr-β基因两者中。

62.根据权利要求45至61中任一项所述的非免疫原性t细胞，其中所述car或所述外源性tcr结合靶细胞表面上呈递的抗原。

63.根据权利要求62所述的非免疫原性t细胞，其中所述抗原是肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原，优选为肿瘤相关抗原。

64.根据权利要求62或63所述的非免疫原性t细胞，其中所述抗原是cd19或cmv衍生抗原。

65.根据权利要求45至64中任一项所述的非免疫原性t细胞，其中所述t细胞是灵长类动物来源的t细胞，优选为人t细胞。

66.一种药物组合物，其包含权利要求41或42所述的免疫细胞群或权利要求43至65中任一项所述的非免疫原性t细胞。

67.根据权利要求41或42所述的免疫细胞群、根据权利要求43至65中任一项所述的非免疫原性t细胞或根据权利要求66所述的药物组合物，其用于治疗方法中。

68.根据权利要求41或42所述的免疫细胞群、根据权利要求43至65中任一项所述的非免疫原性t细胞或根据权利要求66所述的药物组合物，其用于细胞疗法中。

69.根据权利要求67或68所述应用的免疫细胞或非免疫原性t细胞的群，其中所述治疗或疗法针对癌症。

70.根据权利要求69所述应用的免疫细胞群或非免疫原性t细胞，其中所述癌症选自肺癌、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、黑素瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、食管癌、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、包括淋巴瘤和多发性骨髓瘤的淋巴癌、白血病、骨或软组织肉瘤、宫颈癌和外阴癌。

技术总结
本发明涉及一种生产免疫细胞群的方法、通过本发明的方法可获得或获得的免疫细胞群、通过本发明的方法可获得或获得的非免疫原性T细胞、包含本发明的免疫细胞或非免疫原性T细胞的药物组合物，以及涉及所述免疫细胞群、非免疫原性T细胞或药物组合物用于治疗的方法中或用于细胞疗法中。

技术研发人员：M·巴卡尔,L·杰梅罗特
受保护的技术使用者：修复免疫股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6