用于基因编辑的自灭活载体的制作方法

背景技术：

1、基因编辑对于治疗或预防许多遗传疾病具有很大的前景。然而，将crispr基因编辑机制安全且有靶向地递送到期望的细胞中是实现治疗益处所必需的。如腺相关病毒(aav)载体等病毒载体的使用已显示出将crispr组分递送到细胞中以用于编辑靶核酸的前景，具体地在选择适当的血清型的情况下(kotterman ma等人用于基因疗法的病毒载体：翻译和临床前景(viral vectors for gene therapy:translational and clinicaloutlook).《生物医学工程年评(annu.rev.biomed.eng.)》17:63-89(2015))。然而，由aav介导的crispr核酸酶在有丝分裂后细胞中的长期表达引起对特异性、免疫原性和安全性的关注。因此，本领域仍然需要用于将crispr基因编辑机制递送到在进行细胞中核酸的期望的靶上编辑之后自灭活的细胞的组合物和方法。

技术实现思路

1、本公开涉及用于递送crispr核酸酶的自灭活重组载体(sirv)和自灭活腺相关病毒(siaav)载体，并且将rna引导到用于修饰靶核酸的细胞。本文所公开的sirv可以相对于靶核酸的编辑或修饰在时间上控制crispr组分中的一种或多种的表达。

2、如本文所提供的，自灭活重组载体(sirv)表达向导rna和具有单个rna引导的ruvc结构域的2类v型crispr核酸酶，以用于靶细胞和/或组织中的靶核酸的基因编辑，其中在所述靶核酸的编辑之后，所述crispr组分中的一种或多种的表达由自编辑组分减少或消除。减少或消除所述一种或多种crispr组分相对于编辑所述靶核酸的表达的定时由所述sirv的设计控制。本文公开了实现构建体的自灭活特征的多种设计方法。这些方法和其特征也可以组合使用。

3、当并入到病毒载体(例如，siaav)或脂质纳米颗粒中时，与不采用所述自灭活特征的系统相比，本文所公开的sirv的所述自灭活特征在用于受试者中的基因编辑时赋予组合物增强的安全性和更高程度的特异性。如本文所描述的，所述crispr核酸酶和所述向导rna的rnp对自灭活区段(在由所述siaav转导的细胞中呈双链游离型形式)的切割使得所述转基因的一种或多种组分的表达减少或消除。由于自灭活性质，sirv和siaav在用于修饰受试者的细胞群体中的靶核酸时具有增强的安全性特性。

4、另一方面，本公开涉及多核苷酸组合物，所述多核苷酸组合物被设计成在sirv和siaav的产生期间防止包装细胞中由siaav的转基因编码的组分过早降解。

5、本公开还提供了用于用sirv和siaav组合物治疗患有潜在病症或疾病的受试者的方法。

6、通过引用并入

7、本说明书中所提到的所有公开、专利和专利申请均通过以相同的程度引用并入本文，如同特定且单独地指示每个单独的公开、专利或专利申请通过引用并入。

技术特征：

1.一种自灭活重组载体(sirv)，其包括多核苷酸，所述多核苷酸包括：

2.根据权利要求1所述的sirv，其中：

3.根据权利要求1至2中任一项所述的sirv，其中所述自灭活区段包括与所述靶核酸序列的任何15-21个核苷酸部分相对应的序列，所述序列在与由所述2类v型蛋白和所述第一grna的rnp识别的pam序列附近位于3'处。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的sirv，其中：

5.根据权利要求4所述的sirv，其中：

6.根据权利要求4所述的sirv，其中：

7.根据权利要求4所述的sirv，其中：

8.根据权利要求4所述的sirv，其中：

9.根据权利要求1至8中任一项所述的sirv，其中所述一个或多个自灭活区段各自具有约1至约5个碱基，所述碱基不与所述第一grna的所述靶向序列中的对应位置单独互补。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的sirv，其中当在相当条件下进行测定时，所述rnp对在用所述sirv转染或转导的细胞中的所述多核苷酸的所述自灭活区段的切割百分比比对在定时体外基于细胞的测定中的所述细胞中的所述靶核酸的切割低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的sirv，其中当在相当条件下在体外测定中测定时，实现所述rnp对在用所述sirv转染或转导的细胞中的所述多核苷酸的所述自灭活区段的90％切割的时间相对于实现对在所述细胞中的所述靶核酸的90％编辑的时间延迟至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天或至少约9天。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的sirv，其中当在相当条件下进行测定时，所述rnp对在用所述sirv转染或转导的细胞中的所述多核苷酸的所述自灭活区段的切割的k切割速率是对体外基于细胞的测定中的所述靶核酸的切割的k切割速率的至多约1/2、至多约1/4、至多约1/5、至多约1/6、至多约1/7、至多约1/8、至多约1/9或至多约1/10。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的sirv，其中所述rnp对在用所述sirv转染或转导的细胞中的所述多核苷酸的所述自灭活区段的切割使得所述2类v型蛋白或由所述多核苷酸编码的所述grna的表达减少或消除。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的sirv，其中所述2类v型蛋白进一步包括一个或多个核定位信号(nls)，所述一个或多个nls位于所述2类v型蛋白的n末端处或其附近和/或c末端处或其附近。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的sirv，其中所述一个或多个nls选自由以下组成的序列组：pkkkrkv(seq id no:344)、krpaatkkagqakkkk(seq id no:345)、paakrvkld(seq id no:346)、rqrrnelkrsp(seq id no:347)、nqssnfgpmkggnfggrssgpyggggqyfakprnqggy(seq id no:348)、rmrizfknkgkdtaelr rrrvevsvelrkakkdeqilkrrnv(seq id no:349)、vsrkrprp(seq id no:350)、ppkkared(seq id no:351)、pqpkkkpl(seqid no:352)、salikkkkkmap(seq id no:353)、drlrr(seq id no:354)、pkqkkrk(seq idno:355)、rklkkkikkl(seq id no:356)、rekkkflkrr(seq id no:357)、krkgdevdgvdevakkkskk(seq id no:358)、rkclqagmnlearktkk(seq id no:359)、prprkipr(seq id no:360)、pprkkrtvv(seq id no:361)、nlskkkkrkrek(seq id no:362)、rrpsrpfrkp(seq id no:363)、krprspss(seq id no:364)、krgindrnfwrgenerktr(seq idno:365)、prppkma rydn(seq id no:366)、krsfskaf(seq id no:367)、klkikrpvk(seq idno:368)、pktrrrprrsqrkrppt(seq id no:370)、srrrkan ptklsenakklakeven(seq id no:371)、ktrrrprrsqrkrppt(seq id no:372)、rrkkrrprrkkrr(seq id no:373)、pkkksrkpkkksrk(seq id no:374)、hkkkhpdasvnfsefsk(seq id no:375)、qrpgpydrpqrpgpydrp(seq id no:376)、lspslspllspslspl(seq id no:377)、rgkggkglgkggakrhrk(seq id no:378)、pkrgr grpkrgrgr(seq id no:379)、msrrrkanptklsenakklakeven(seq id no:598)、pkkkrkvppppaakrvkld(seq id no:380)、pkkkrkvppppkkkrkv(seq id no:381)、pakrarrgykc(seq id no:382)、klgprkatgrw(seqid no:383)、prrkree(seq id no:384)、plrkrprr(seq id no:386)、plrkrprrgsplrkrprr(seq id no:387)、paakrvkldggkrtadgsefespkkkrkv(seq id no:388)、paakrvkldggkrtadgsefespkkkrkvgihgvpaa(seq id no:389)、paakrvkldggkrtadgsefespkkkrkvaeaaakeaaakeaaaka(seq id no:390)、paakrvkldggkrtadgsefespkkkrkvpg(seq id no:391)、krkgspergerkrhw(seq id no:392)、krtadsqhstppk tkrkvefepkkkrkv(seq id no:393)、pkkkrkvggskrtadsqhs tppktkrkvefepkkkrkv(seq id no:394)、mapkkkrkvsr(seq id no:771)和mapkkkrkvggspkkkrkvggspkkkrkvggspkkkrk vsr(seq id no:772)，其中所述一个或多个nls通过连接子肽与所述v型蛋白或邻近的nls连接，其中所述连接子肽选自由以下组成的组：rs、(g)n(seq id no:395)、(gs)n(seq id no:396)、(gsggs)n(seq id no:397)、(ggsggs)n(seq id no:398)、(gggs)n(seq id no:399)、ggsg(seq id no:400)、ggsgg(seqid no:401)、gsgsg(seq id no:402)、gsggg(seq id no:403)、gggsg(seq id no:404)、gsssg(seq idno:405)、gpgp(seq id no:406)、ggp、ppp、ppappa(seq id no:407)、pppg(seq id no:408)、pppgppp(seq id no:409)、ppp(gggs)n(seq id no:410)、(gggs)nppp(seq id no:411)、aeaaakeaaakeaaaka(seq id no:412)和tppktkrkvefe(seq id no:413)，其中n是1至5。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的sirv，其中一个或多个经编码的nls选自由以下组成的组：表7、表22和表23中所示的seq id no:538-597、599-610、613、771-772、844-846和2498-2591。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的sirv，其中所述2类v型蛋白是casx蛋白，所述casx蛋白选自由seq id no:1-3、49-321和2356-2488组成的序列组，或与其具有至少约70％、至少约80％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的sirv，其中所述第一grna具有支架，所述支架包括选自由seq id no:2101-2331、3992-3995和4028组成的序列组的序列，或与其具有至少约70％、至少约80％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。

19.根据权利要求1至19中任一项所述的sirv，其中所述第一grna包括具有15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸或20个核苷酸的靶向序列。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的sirv，其中所述casx蛋白当在所述细胞中表达时能够与所述第一grna形成核糖核蛋白复合物(rnp)。

21.根据权利要求20所述的sirv，其中所述rnp能够切割所述靶核酸和所述自灭活区段。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的sirv，其中包装元件包括aav 5'和3'反向末端重复序列(itr)，其中所述aav 5'和3'itr源自血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav 44.9、aav 9.45、aav 9.61、aav-rh74、aavrh10或其嵌合组合。

23.根据权利要求22所述的sirv，其中所述itr源自血清型aav2。

24.一种sirv，其包括多核苷酸，所述多核苷酸包括：

25.根据权利要求24所述的sirv，其包括组分(a)-(f)和(i)。

26.根据权利要求24所述的sirv，其包括组分(a)-(e)、(g)和(i)。

27.根据权利要求24所述的sirv，其包括组分(a)-(e)、(h)和(i)。

28.根据权利要求24至27中任一项所述的sirv，其中：

29.根据权利要求28所述的sirv，其中所述自灭活区段包括15-21个核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述第二grna的所述靶向序列互补，并且在由所述2类v型蛋白和所述第二grna的rnp识别的pam序列附近位于3'处。

30.根据权利要求24至29中任一项所述的sirv，其中所述2类v型蛋白和所述第二grna的所述rnp对在用所述sirv转导或转染的细胞中的所述自灭活区段的切割使得所述2类v型蛋白或由所述多核苷酸编码的所述grna的表达减少或消除。

31.根据权利要求24至30中任一项所述的sirv，其中：

32.根据权利要求31所述的sirv，其中：

33.根据权利要求31所述的sirv，其中：

34.根据权利要求31所述的sirv，其中：

35.根据权利要求31所述的sirv，其中：

36.根据权利要求24至35中任一项所述的sirv，其中所述一个或多个自灭活区段序列各自具有1至5个碱基，所述碱基不与所述第二grna的所述靶向序列中的对应位置互补。

37.根据权利要求24至36中任一项所述的sirv，其中与所述2类v型蛋白和所述第一grna的所述rnp对所述细胞的所述靶核酸的切割相比，所述2类v型蛋白和所述第二grna的所述rnp表现出对所述自灭活区段的切割效率降低。

38.根据权利要求24至37中任一项所述的sirv，其中所述第三启动子序列与所述第二启动子序列不同，并且与启动所述第一grna的转录的第二启动子相比，所述第三启动子序列启动所述第二grna的转录的效率较低。

39.根据权利要求38所述的sirv，其中所述第二启动子是u6，并且第三启动子选自由h1、7sk和迷你u6组成的组。

40.根据权利要求24至39中任一项所述的sirv，其中所述2类v型蛋白进一步包括一个或多个核定位信号(nls)。

41.根据权利要求24至40中任一项所述的sirv，其中所述v型蛋白是casx蛋白，所述casx蛋白选自由以下组成的组：seq id no:1-3和49-321和2356-2488，或与其具有至少约70％、至少约80％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。

42.根据权利要求24至41中任一项所述的sirv，其中第二向导包括选自由seq id no:2101-2238组成的组的序列，并且第一向导包括选自由seq id no:2276-2296组成的组的序列。

43.根据权利要求24至42中任一项所述的sirv，其中所述第一grna和所述第二grna各自包括具有15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸或20个核苷酸的靶向序列。

44.根据权利要求41至43中任一项所述的sirv，其中所述casx蛋白当在用所述sirv转导或转染的细胞中表达时能够与所述第一grna和所述第二grna形成核糖核蛋白复合物(rnp)。

45.根据权利要求44所述的sirv，其中所述casx蛋白和所述第一grna的所述rnp能够切割所述靶核酸，并且其中所述casx蛋白和所述第二grna的所述rnp能够切割所述自灭活区段，并且其中与所述casx蛋白和所述第一grna的所述rnp对所述靶核酸的切割或切割速率相比，所述casx蛋白和所述第二grna的所述rnp表现出对所述自灭活区段的切割速率效率较低。

46.根据权利要求24至45中任一项所述的sirv，其中包装元件是aav 5'和3'反向末端重复序列(itr)，其中所述aav5'和3'itr源自血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav 44.9、aav 9.45、aav 9.61、aav-rh74、aavrh10或其嵌合组合。

47.根据权利要求1至46中任一项所述的sirv，其中所述多核苷酸包括选自由seq idno:4151-4156组成的组的序列，或与其具有至少约70％、至少约80％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％序列同一性的序列。

48.一种自灭活病毒源性颗粒，其包括

49.一种修饰细胞中的靶核酸序列的方法，所述方法包括用根据权利要求1至47中任一项所述的sirv转染所述细胞，其中所述靶核酸序列由经表达的2类v型蛋白和所述第一grna的rnp修饰。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述修饰包括在所述细胞的所述靶核酸序列中引入单链断裂或双链断裂。

51.根据权利要求49所述的方法，其中所述修饰包括在所述细胞的所述靶核酸序列中引入插入、缺失或突变。

52.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述自灭活区段在所述细胞的所述靶核酸序列的所述修饰之后由所述2类v型蛋白和所述第一grna的rnp切割。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述自灭活区段在所述靶核酸序列的所述修饰之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天被切割。

54.根据权利要求49至53中任一项所述的方法，其中与用不包括所述自灭活区段的sirv转导的细胞相比，所述自灭活区段的所述切割使得所述细胞中的核酸序列的脱靶修饰减少。

55.根据权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述自灭活区段的所述切割使得所述细胞中的所述2类v型蛋白的表达减少或消除。

56.一种组合物，其包括：

57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述aav表达盒包括

58.根据权利要求56或权利要求57所述的组合物，其中所述多核苷酸包括一个、两个或三个shrna和连接的启动子的编码序列。

59.根据权利要求56至58中任一项所述的组合物，其中所述shrna编码序列包括选自由seq id no:2640-2687组成的组的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％同一性的序列。

60.根据权利要求56中任一项所述的组合物，其中包括所述shrna和所述连接的启动子的所述多核苷酸与并入到细菌质粒主链中的aav转基因的外部连接。

61.根据权利要求56至60中任一项所述的组合物，其中包括所述shrna和所述连接的启动子的所述多核苷酸插入到以下中：

62.根据权利要求57至61中任一项所述的组合物，其中经编码的2类v型蛋白包括选自由seq id no:1-3、49-321和2356-2488组成的组的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。

63.根据权利要求57至62中任一项所述的组合物，其中所述第一grna包括支架序列，所述支架序列选自由seq id no:2101-2331、3992-3995和4028组成的序列组，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％同一性的序列。

64.根据权利要求57至63中任一项所述的组合物，其中所述2类v型蛋白和grna编码序列能够在用所述aav表达盒转染的包装细胞中被转录。

65.根据权利要求56至64中任一项所述的组合物，其中所述shrna能够在用所述多核苷酸转染的包装细胞中表达和加工成sirna序列，所述sirna序列与由所述包装细胞转录的所述2类v型蛋白的mrna互补并能够与其杂交。

66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述包装细胞选自由以下组成的组：幼仓鼠肾(bhk)、人胚胎肾293(hek293)、hek293t、ns0、sp2/0、yo骨髓瘤细胞、a549、p3x63小鼠骨髓瘤细胞、per、per.c6、nih3t3、cos、hela和中国仓鼠卵巢(cho)。

67.根据权利要求65或权利要求66所述的组合物，其中在所述sirna序列与所述2类v型蛋白的所述mrna杂交时，所述2类v型蛋白mrna降解，使得所述2类v型蛋白在所述包装细胞中的表达减少或消除。

68.根据权利要求67所述的组合物，其中当在相当条件下在定时体外测定中测定时，与不包括所述shrna的经转染的包装细胞相比，所述2类v型蛋白的表达减少至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

69.根据权利要求57至68中任一项所述的组合物，其中所述aav表达盒包括

70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述第二grna包括支架序列，所述支架序列选自由seq id no:2101-2331、3992-3995和4028组成的序列组，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％同一性的序列。

71.根据权利要求69或权利要求70所述的组合物，其中：

72.根据权利要求69至71中任一项所述的组合物，其中所述自灭活区段包括15-21个核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述第二grna的所述靶向序列互补，并且在由所述2类v型蛋白和所述第二grna的rnp识别的pam序列附近位于3'处。

73.根据权利要求69至72中任一项所述的组合物，其中所述2类v型蛋白和所述第二grna的所述rnp对在用所述组合物转导的细胞中的所述自灭活区段的切割使得所述2类v型蛋白或由所述多核苷酸编码的所述grna的表达减少或消除。

74.根据权利要求69至73中任一项所述的组合物，其中与位于所述待修饰细胞的所述靶核酸的5'处且位于所述靶核酸附近的所述pam序列相比，所述一个或多个自灭活区段的所述pam序列促进所述2类v型蛋白和所述第二grna的所述rnp对所述自灭活区段的切割效率或切割速率降低。

75.一种用于减少包装细胞中编码2类v型核酸酶蛋白和一种或多种grna的自灭活aav(siaav)转基因的过早切割的方法，所述方法包括将编码一个或多个小发夹rna(shrna)的多核苷酸序列引入到包括所述siaav转基因的所述包装细胞中，其中所述shrna能够被表达并加工成sirna序列，并且其中所述sirna序列与由所述包装细胞转录的所述2类v型核酸酶的mrna互补。

76.根据权利要求75所述的方法，其中所述包装细胞是用所述siaav转基因转染的。

77.根据权利要求75或权利要求76所述的方法，其中所述转基因包括

78.根据权利要求75至77中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包括一个、两个或三个shrna和连接的启动子的编码序列。

79.根据权利要求75至78中任一项所述的方法，其中所述shrna编码序列包括选自由seq id no:2640-2687组成的组的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％同一性的序列。

80.根据权利要求78或权利要求79所述的方法，其中包括所述shrna和所述连接的启动子的所述多核苷酸与插入到细菌质粒主链中的aav转基因的外部连接。

81.根据权利要求78至80中任一项所述的方法，其中包括所述shrna和所述连接的启动子的所述多核苷酸插入到以下中：

82.根据权利要求75至81中任一项所述的方法，其中所述包装细胞选自由以下组成的组：bhk、hek293、hek293t、ns0、sp2/0、yo骨髓瘤细胞、a549、p3x63小鼠骨髓瘤细胞、per、per.c6、nih3t3、cos、hela和cho。

83.根据权利要求75至82中任一项所述的方法，其中在所述shrna和2类v型v型核酸酶序列转录时，所述shrna被加工成与所述2类v型核酸酶的所述mrna杂交并由所述包装细胞降解的sirna。

84.根据权利要求83所述的方法，其中当在相当条件下在定时体外测定中测定时，与不包括所述shrna序列的经转染的包装细胞相比，所述包装细胞中的所述2类v型核酸酶蛋白的表达被阻遏至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

85.根据权利要求75至84中任一项所述的方法，其中所述2类v型核酸酶蛋白是casx，所述casx包括选自由seq id no:1-3、49-321和2356-2488组成的组的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。

86.根据权利要求77至85中任一项所述的方法，其中所述第一grna和所述第二grna各自具有支架，所述支架包括选自seq id no:2101-2331、3992-3995和4028的序列组的序列，或与其具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的序列。

87.根据权利要求77至85中任一项所述的方法，其中第二向导包括选自由seq id no:2101-2238组成的组的序列，并且第一向导包括选自由seq id no:2276-2296组成的组的序列。

技术总结
本文提供了用于使用编码2类V型和向导核糖核酸(gRNA)序列的自灭活重组载体(SIRV)的组合物和方法，所述SIRV可用于核酸序列编辑，并且包含自灭活组分。所述SIRV可以作为AAV载体的一部分递送到细胞以靶向所关注基因。

技术研发人员：K·巴尼,I·科林,C·福特尼,S·希金斯,S·马基雅,B·T·斯塔尔,M·阿迪尔,B·奥克斯,A·赖特,A·西多尔,M·莫哈,S·邓尼
受保护的技术使用者：斯克里贝治疗公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/20