基因编辑方法、基因编辑方法得到的细胞、基因编辑系统及其应用与流程

本发明涉及分子生物学及遗传学领域，具体涉及一种基因编辑方法、基因编辑方法得到的细胞、基因编辑系统及其应用。

背景技术：

1、crispr/cas系统是来自于细菌与古细菌的一种免疫形式，crispr(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)为规律间隔成簇短回文重复序列，cas(crispr-associated genes)为crispr相关基因，自1987年首次发现该序列之后，crispr/cas系统迅速被科研人员所利用，并成为目前最主流的基因编辑工具。例如，可以通过crispr/cas系统诱发同源重组修复(homology-directedrepair，hdr)，利用hdr可以通过具有同源序列的内源或外源dna模板进行重组的机制，引入带有基因编辑序列的供体质粒(donorplasmid)，供体质粒还可带有筛选标记，其通常被引入到基因组的内含子中，以便对基因编辑成功的细胞进行筛选。由于内含子不会影响mrna正常转录，现有技术通常在内含子中插入筛选标记后并不将其去除。然而，内含子在基因转录翻译中起调控作用，插入内含子中的序列可能对细胞产生未知的遗传影响，且稳定的筛选标记使细胞带有了荧光或抗生素的抗性，限制对该细胞进行其它改造和检测的手段。有研究通过在筛选标记的上下游插入同方向的loxp序列，在得到编辑后克隆通过导入cre重组酶来切除筛选标记。该技术中虽然切除了绝大部分筛选标记，但是由于cre-loxp系统自身特点，会在原位点留下一个34bp的loxp序列。cre-loxp系统虽然较未切除筛选标记的方法有所改进但是仍未做到真正的无痕编辑。

2、目前通过crispr系统进行精确基因编辑的方法包括胞嘧啶碱基编辑器(cbe)、腺嘌呤碱基编辑器(abe)和先导编辑器(primeeditor，pe)。cbe与abe只能完成特定的四种碱基转换，不能完成碱基的插入，而且有研究发现cbe或abe编辑后诱发了大量非靶向突变。并且cbe存在一定几率错误编辑的情况并可能引入碱基插入或缺失。pe系统复杂，获得编辑成功克隆的概率很低。另外，三种编辑器均涉及将cas9和相关酶构建成融合蛋白，由于融合蛋白较大，三种编辑器均较难以完成向细胞内递送，进一步限制了其成功率。并且，碱基编辑器对单碱基编辑精准性并不尽如人意。

3、因此，亟需一种具有较高基因编辑成功率的无痕基因编辑系统和方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种基因编辑方法、基因编辑方法得到的细胞、基因编辑系统及其应用。本发明的方法能够实现对目标细胞的无痕基因编辑，并且操作简单，更适用于细胞系的构建。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种进行基因编辑的方法，所述方法包括：

3、(1)将表达载体i、供体质粒转染至目标细胞中，得到阳性细胞库；

4、(2)将阳性细胞库中的阳性细胞进行纯合子细胞筛选，得到纯合子细胞；

5、(3)将表达载体ii转至纯合子细胞中，进行对筛选标记基因表达盒无痕切割，得到纯合子克隆；

6、其中，所述表达载体i能够表达cas9和sgrna1；

7、所述表达载体ii能够表达sgrna2-1、sgrna2-2和cas9；

8、所述sgrna1能够和cas9结合对细胞的基因组中外显子n和外显子n+1之间的内含子m进行切割；

9、所述供体质粒含有外显子n’和内含子m’的同源臂，所述外显子n’的序列包括基因编辑后的外显子n上发生了基因编辑处的序列，所述内含子m’的序列为在内含子m的sgrna1的靶点中插入有筛选标记基因表达盒的序列；

10、所述sgrna2-1、sgrna2-2能够和cas9结合对内含子m’上的筛选标记基因表达盒序列进行切割

11、本发明第二方面提供一种通过如前所述的方法得到的细胞。

12、本发明第三方面提供一种基因编辑系统，所述系统包括如前所述的表达载体i、表达载体ii和供体质粒。

13、本发明第四方面提供如前所述的系统在无痕基因编辑中的应用。

14、本发明利用crispr/cas9基因编辑技术，在基因内含子上寻找sgrna的靶点以及sgrna的靶序列，进而设计sgrna序列，sgrna能够与内含子的靶序列结合并引导核酸内切酶cas9切割dna双链产生双链断裂。产生双链断裂后，通过细胞自身同源重组修复途径将供体质粒上的带有基因编辑和筛选标记基因表达盒的同源臂由双链断裂处整合至基因组中。为了获得“无痕”编辑的克隆，本发明根据整合至基因组中的筛选标记基因表达盒及其上下游序列设计了两个sgrna，分别命名为sgrna2-1与sgrna2-2，通过sgrna2-1、sgrna2-2及核酸内切酶cas9切除整合至基因组上的筛选标记，断裂的dna链通过非同源末端连接的修复方式修复为dna双链，以达到无痕编辑的目的。

15、本发明的一些优选的实施方式中，所述方法的原理为：首先在基因内含子上设计sgrna序列，另设计具有筛选标记的供体质粒，通过细胞自身同源重组修复途径将供体质粒上的带有基因编辑和筛选标记基因表达盒的同源臂由双链断裂处整合至基因组中。后在筛选标记前后共设计两个sgrna，通过这2个sgrna及核酸内切酶cas9切除整合至基因组上的筛选标记，断裂的dna链通过非同源末端连接的修复方式修复为dna双链，以达到无痕编辑的目的。

16、通过上述技术方案，本发明获得的有益效果至少包括：

17、(1)本发明的系统和方法使用范围广泛，可以获得稳定的基因编辑(例如基因点突变或敲入序列)的细胞株，且适用于多种细胞；

18、(2)使用双链dna形式的供体质粒作为同源修复模板，可以导入片段较大的筛选标记，如荧光蛋白基因gfp、mcherry等或抗生素抗性蛋白基因puror、hygr等；

19、(3)本发明选择在内含子中设计sgrna1的靶点，可以避免修复过程中可能引入的碱基插入或缺失造成外显子基因突变；

20、(4)本发明中使用的供体质粒较小，便于向细胞内递送；

21、(5)本发明可以实现无痕期初筛选标记基因表达盒，达到无痕编辑的目的，避免导致未知的转录或剪切错误。

技术特征：

1.一种进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述启动子为ef1α、cmv启动子、ef1a启动子和cag启动子中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述荧光蛋白基因为绿色荧光蛋白和/或红色荧光蛋白；

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述基因编辑为点突变或敲入；

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，步骤(3)还包括：将表达载体ii转至纯合子细胞中后对细胞进行荧光阴性细胞筛选。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，所述目标细胞为rpe细胞、293t细胞和a549细胞中的至少一种，优选为rpe细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述目标细胞为rpe细胞，所述外显子n的序列如seq id no.26所示；

8.一种通过权利要求1-7中任意一项所述的方法得到的细胞。

9.一种基因编辑系统，其特征在于，所述系统包括：表达载体i、表达载体ii和供体质粒；

10.权利要求9所述的系统在无痕基因编辑中的应用。

技术总结
本发明涉及分子生物学及遗传学领域，公开了基因编辑方法、基因编辑方法得到的细胞、基因编辑系统及其应用。所述方法包括：(1)将表达载体I、供体质粒转染至目标细胞中，得到阳性细胞库；(2)将阳性细胞库中的阳性细胞进行纯合子细胞筛选，得到纯合子细胞；(3)将表达载体II转至纯合子细胞中，进行对筛选标记基因表达盒无痕切割，得到纯合子克隆。本发明的系统和方法使用范围广泛，可以获得稳定的基因编辑的细胞株，且适用于多种细胞。

技术研发人员：王承志
受保护的技术使用者：北京镁伽机器人科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12