一种检测γ-谷氨酰转肽酶的近红外荧光探针及其制备方法和应用

本发明涉及一种荧光探针，具体涉及一种近红外荧光探针，还涉及其制备方法和在检测γ-谷氨酰转肽酶方面的应用，属于有机小分子荧光探针。

背景技术：

1、γ-谷氨酰转肽酶(ggt)是一种可催化γ-谷氨酸键切割，在维持细胞稳态方面起着重要的生物学功能的酶。目前已报道ggt过表达与多种人类肿瘤有关，ggt不仅是肿瘤生物标志物，也是肝损伤，肝炎和许多其他疾病的信号酶。ggt在正常血清中含量较低(5～85u/l)，而在某些肝疾病中可以达到很高的值(>200u/l)。

2、近年来，许多荧光探针已经被设计出来用于检测ggt，但大多数探针在实际应用方面尚存在一些问题并有待解决，一方面，许多检测ggt的探针采用短波激发/发射的荧光团，会有自发荧光背景、光损伤和衰减信号的弱点，使得其在检测临床和生物样本中的ggt水平仍存在困难。尽管一些具有近红外(nir)激发和发射的荧光探针被开发并应用于检测ggt水平，但大部分nir染料普遍存在stokes位移小、光稳定性差等缺点，导致探针不能高分辨以及灵敏、准确的对体内ggt表达水平进行成像分析。另一方面，部分探针由于追求更低的检出限和更高的灵敏度，导致其最大检出浓度往往低于正常ggt水平，而不能有效地为相关疾病诊断提供科学数据支撑。因此，进一步开发性能优良的nir荧光染料并构建适用于实际样品中ggt检测的荧光探针，将有利于深入了解ggt异常导致疾病发生发展的生理病理过程。

技术实现思路

1、针对现有技术中用于监测ggt水平荧光探针存在的不足，本发明的第一个目的是在于提供一种荧光探针，该荧光探针具有优异的nir荧光性质，能够高选择性、准确地与ggt进行结合，发出强烈的荧光信号，能够实现对ggt的定量检测。

2、本发明的第二个目的是在于提供一种nir荧光探针的制备方法，该制备方法操作简单、流程短、条件温和，有利于扩大生产。

3、本发明的第三个目的是在于提供一种荧光探针在ggt检测方面的应用，该荧光团具有优异的nir性质，对比于传统的花菁染料，其具有更高的荧光发射波长，更强的光稳定性，为后续的nir荧光探针的设计提供了一种新思路。

4、为了实现上述技术目的，本发明提供了一种荧光探针，其具有式1结构：

5、

6、本发明的荧光探针是具有二氰基亚甲基苯并吡喃(dcm)的类花菁(cy)结构。将传统的花菁染料中一边的吲哚结构替换为吸电子能力更强的dcm基团，破坏了cy染料的对称性，使荧光团的斯托克斯位移(stokes shift)增大并提高了探针的光稳定性，同时利用gsh引入了对ggt具有选择性识别的官能基团，使得探针能选择性的响应ggt，在与ggt结合后在825nm处发出强荧光，荧光发射峰增加10倍左右，检出限为1.393u/l，最大检出浓度可到1000u/l。因此，该探针在生物样本检测中和后续的探针设计中有着很好的应用前景。

7、本发明还提供了一种荧光探针的制备方法，该方法是将式2结构氯化合物和

8、式3结构巯基化合物进行取代反应，即得；

9、

10、

11、作为一个优选的方案，含氯化合物和含巯基化合物按等摩尔比反应。

12、作为一个优选的方案，含氯化合物和含巯基化合物在三乙胺存在下于dmf溶剂中进行取代反应。

13、作为一个较优选的方案，所述三乙胺用量为含甲基化合物摩尔量的1～3倍。

14、作为一个优选的方案，所述取代反应的条件为：在30～60℃温度下，反应12～24h。

15、本发明还提供了一种荧光探针的应用，应用于ggt检测。特别是作为nir荧光探针使用，其对ggt具有高选择性识别，且荧光信号强烈，能够实现对ggt的定量检测。

16、本发明的nir荧光探针的合成路线如下：

17、

18、本发明的nir荧光探针的具体合成步骤为：将化合物2(式2结构含氯化合物)和化合物3(式3结构含巯基化合物)加入至双口烧瓶中，在氮气保护下加入dmf和三乙胺，加热至50℃反应16h，待冷却至室温后，通过减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物。将粗产物用硅胶柱纯化(洗脱剂：dcm:meoh＝100：0至0：100，v/v)，得到化合物绿色固体(式1结构nir荧光探针)；其中，化合物2、化合物3和三乙胺的物质的量比为1:10:1～3，dmf的体积为10～15ml，温度为40～60℃，时间为12～24h。

19、本发明的化合物2的合成路线如下：

20、

21、具体合成步骤为：将化合物4和化合物5加入至双口烧瓶中。在氮气保护下加入甲苯与哌啶。混合体系加热回流反应24h。应完成后，待混合体系自然冷却至室温后，旋蒸除去溶剂。将粗产物用硅胶柱纯化(洗脱剂：dcm:meoh＝100：0→100：10，v/v)，获得蓝色固体。其中，化合物4、化合物5和哌啶的物质的量比为1:1.2:0.2～0.5，甲苯的体积为10～15ml，回流温度为110～115℃，时间为20～24h。

22、本发明的化合物cy-nh的合成路线如下：

23、

24、具体合成步骤为：将化合物6加入至双口烧瓶中。在氮气保护下加入盐酸甲胺、三乙胺与dmf。混合体系加热至80℃反应4h。应完成后，待混合体系自然冷却至室温后，减压蒸馏除去溶剂。将粗产物用硅胶柱纯化(洗脱剂：dcm:meoh＝100：0至100：5，v/v)，获得蓝色固体。其中，化合物6和和盐酸甲胺和三乙胺的物质的量比为1:1～5:1～5，dmf的体积为5～20ml，温度为70～90℃，时间为3～12h。

25、本发明的化合物cy-dcm的合成路线如下：

26、

27、具体合成步骤为：将化合物2加入至双口烧瓶中。在氮气保护下加入盐酸甲胺、三乙胺与dmf。混合体系加热至80℃反应4h。应完成后，待混合体系自然冷却至室温后，减压蒸馏除去溶剂。将粗产物用硅胶柱纯化(洗脱剂：dcm:meoh＝100：0至100：10，v/v)，获得蓝色固体。其中，化合物2和盐酸甲胺和三乙胺的物质的量比为1:1～20：1～20，dmf的体积为5～20ml，温度为70～90℃，时间为3～12h。

28、相对现有技术，本发明技术方案带来的有益技术效果：

29、本发明提供的nir荧光探针，将传统的cy染料进行结构改进，引入吸电子能力更强的dcm基团，使荧光团的发射峰红移，斯托克斯位移增加，光稳定性增强，同时引入了可以高选择性识别ggt的官能团，该探针与ggt响应后在825nm处出现强荧光，并能检测高浓度的ggt，在生物样本的检测中有着很好的应用前景。

30、本发明的nir荧光探针的制备方法操作简单、流程短、条件温和，有利于扩大生产。

技术特征：

1.一种荧光探针，其特征在于：具有式1结构：

2.权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：将式2结构含氯化合物和式3结构含巯基化合物进行取代反应，即得；

3.根据权利要求2所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：含氯化合物和含巯基化合物按等摩尔比反应。

4.根据权利要求2或3所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：含氯化合物和含巯基化合物在三乙胺存在下于dmf溶剂中进行取代反应。

5.根据权利要求4所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：

6.根据权利要求1或5所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：所述取代反应的条件为：在30～60℃温度下，反应10～12h。

7.权利要求1所述的一种荧光探针的应用，其特征在于：应用于ggt检测。

技术总结
本发明公开了一种荧光探针及其制备方法和在GGT检测中的应用。荧光探针其具有以下结构：该荧光探针对GGT具有高选择性识别，且与GGT响应后荧光发射峰达到825nm，与传统的Cy染料相比，具有更大的斯托克斯位移(＞150nm)，更好的光稳定性，具有广泛的应用前景。

技术研发人员：李银辉,文蕾,彭超
受保护的技术使用者：湘潭大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12