一种基于内镜活检肿瘤组织样本构建消化道肿瘤患者来源类器官的方法

本发明涉及一种基于内镜活检肿瘤组织样本构建消化道肿瘤患者来源类器官(pdo)的方法，属于生物类器官。

背景技术：

1、患者来源类器官(patient derived organoid，pdo)是利用患者的肿瘤组织在体外，以在各种必要的生长因子模拟机体内环境的条件下进行三维立体培养，能够反映来源肿瘤的组织形态学和基因组学特征。pdo包含了不同组织来源的上皮细胞结构，具有增殖及分化的能力，保留原代肿瘤组织固有的异质性和生物学行为，可以在一定程度上替代相关动物模型，减少实验动物使用数量，在临床前抗肿瘤药物开发、新药细胞毒性研究、肿瘤发生驱动基因研究、个体化肿瘤治疗及肿瘤免疫学研究中有广泛应用前景。

2、然而既往传统的pdo模型建立有赖于手术标本的获得。如患者为晚期肿瘤或转移肿瘤无法进行手术治疗、无法获得手术标本，则不能建立pdo模型，在科研方面失去了宝贵的研究样本，在临床方面使患者失去了利用pdo筛选敏感药物的机会。但内镜下活检样本由于样本量少而消化收获细胞不足，且处理过程中细胞活性低，导致类器官培养的成功率非常低，制约了类器官在小样本培养中的应用。

3、而且，不同组织来源类器官在遗传学背景、组织结构及细胞间通讯特征等方面存在巨大差异，从而需要不同浓度的各类特异性因子依据特定顺序序贯加入作为诱导剂，因此“千人一面”的培养试剂并不适用。综上，有必要针对内镜获取组织样本来源类器官，开发一套完善、灵活的模块化类器官培养方案。

技术实现思路

1、本发明的目的是：针对现有类器官构建过程中存在的问题与缺陷，提出一种类器官构建方法，以解决使用以内镜下获得微量肿瘤样本建立pdo模型的难题，该构建方法提高了构建消化道肿瘤类器官的成功率。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种基于内镜活检肿瘤组织样本构建消化道肿瘤患者来源类器官的方法，包括如下步骤：

3、步骤1：将获取的内镜活检肿瘤组织样本以50ml洗涤液冲洗3次以上，冲洗后离心获取组织碎片，再放入保存液中，其中，所述洗涤液为包含多粘菌素e4mg/l，氨苄青霉素100g/l和链霉素50g/l的生理盐水溶液，所述保存液为含有1％青霉素-链霉素双抗，1×hepes缓冲液，5％1,6-二磷酸果糖，和20％牛血清白蛋白bsa的advanced dmem/f-12培养基；

4、步骤2：将步骤1保存液中的组织样本于15min内进行离心分离，加入消化液后，于摇床上进行振荡消化，获得消化悬液，其中，所述消化液的成分包含：gibicotrypletmexpress 1×，fasudil hydrochloride 5μm，维生素a 10μg/ml，维生素c10μg/ml；

5、步骤3：将步骤2获得的消化悬液过滤，收集直径小于40μm的单细胞悬液，离心后放弃上清，用100μl pdo培养基重悬沉淀，获得单细胞悬液并进行细胞计数；

6、步骤4：将matrigel基质胶和步骤3所得的单细胞悬液按照1:1混合，将混合后的matrigel基质胶接种于多孔板内，并将孔板倒置于37℃细胞培养箱中培养30min，使matrigel基质胶凝固后，向多孔板内加入pdo培养基；

7、步骤5：培养3天后观察pdo培养基中pdo的生长情况，并进行换液培养；

8、其中，所述步骤3和步骤4中的pdo培养基的组成包括：

9、

10、

11、本发明还提供了上述方法构建的消化道肿瘤患者来源类器官。

12、本发明还提供了一种结肠癌类器官，采用上述方法构建得到，所述内镜活检肿瘤组织样本为结肠癌组织样本。

13、本发明还提供了上述方法构建的消化道肿瘤患者来源类器官在筛选抗消化道肿瘤药物中的应用。

14、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

15、本发明使用内镜样本构建pdo模型，虽然pdo建立流程已较为成熟，然而内镜来源的标本具有总量小、污染多的特点，成瘤率极低；依托临床实践，本发明主要优化要点包括：

16、①优化了样本冲洗液及保存液的配方：消化道内获取样本污染严重，如不彻底冲洗将影响成瘤效果；消化道内含有多种消化液，ph值异常会影响肿瘤活性；消化道内样本以革兰氏阴性为主，本发明方案中优化了冲洗液及保存液，在保存液中加入强缓冲液以保证保存环境的ph值，加入了高浓度的青链霉素和多粘菌素e，抑制细菌污染，其次通过至少50ml冲洗液冲洗3次以上洗脱各类生物及非生物污染；

17、②优化了组织消化液，将孵育液中加入了多种细胞膜保护成分，抵抗了蛋白酶消化对细胞的损伤；

18、③优化了培养液，加入了多种生长因子，更加适应胃肠道微量肿瘤组织的生长及分化；

19、因此，本发明提供的pdo构建方法拓宽了pdo建立来源，为肿瘤临床治疗及研究提供一个较理想的临床前体外药筛平台，从而为改善患者的总体预后提供有力支持。

技术特征：

1.一种基于内镜活检肿瘤组织样本构建消化道肿瘤患者来源类器官的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.权利要求1所述的方法构建的消化道肿瘤患者来源类器官。

3.一种结肠癌类器官，其特征在于，采用权利要求1所述的方法构建得到，所述内镜活检肿瘤组织样本为结肠癌组织样本。

4.权利要求1所述的方法构建的消化道肿瘤患者来源类器官在筛选抗消化道肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于内镜活检肿瘤组织样本构建消化道肿瘤患者来源类器官的方法。本发明方法通过优化样本冲洗液及保存液的配方、组织消化液的配方和优化了培养液的配方，孵育液中加入了多种细胞膜保护成分，抵抗了蛋白酶消化对细胞的损伤；培养液中加入了多种生长因子，更加适应胃肠道微量肿瘤组织的生长及分化，该方法极大地提高了构建消化道肿瘤类器官的成功率，解决了目前内镜来源的标本总量小、污染多而造成成瘤率极低的难题；本发明提供的PDO构建方法拓宽了PDO建立来源，为肿瘤临床治疗及研究提供一个较理想的临床前体外药筛平台，从而为改善患者的总体预后提供有力支持。

技术研发人员：付佩尧,诸炎,耿子寒,胡晓元,屈一帆,李全林,钟芸诗,周平红
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11