链交换等温扩增结合纳米荧光微球-免疫层析技术快速精准检测婴儿肺炎克雷伯菌新方法

本发明属于生物医学检测，涉及一种链交换等温扩增(sea)结合纳米荧光微球-免疫层析技术(ficts)快速精准检测婴儿肺炎克雷伯菌新方法。

背景技术：

1、肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)近年来已成为社区获得性感染和医院内感染最重要的病原菌之一，它可以导致细菌性肺炎、肝脓肿、败血症，神经系统疾病等，及其他危及生命的后果。临床调查中发现，耐药性肺炎克雷伯氏菌具有高度传染性，特别是在婴儿身上，因为他们的免疫系统十分脆弱。肺炎克雷伯氏菌引起的感染通常伴随着高死亡率，这使得临床抗感染治疗面临严峻挑战。

2、目前，传统基于培养技术结合生化实验的细菌检测法是目前临床检测的常规方法，但是该类方法步骤较多，检测时间较长，其准确性和灵敏度仍需进一步提高；此外，检测技术人员的操作水平和经验也对该检测结果的准确性有重要影响；以抗体为主要基础的免疫学方法可以缩短检测时间，但抗体的质量和特异性将会影响检测结果，而且还有很多病原菌找不到合适的抗体，限制该方法在临床应用的广度与范围。可见，传统病原菌临床检测技术耗时长，且漏检严重，无法满足临床诊疗需求。目前，基于pcr的方法因其灵敏、简单的优势被国内外研究者广泛应用，但是此类方法需要严格的温控装置，并且容易发生模板和引物之间的碱基错配，从而产生假阳性或假阴性。而基因芯片、测序、maldi-tof ms技术和sers技术等，尽管有各自优势，但因配套设备昂贵，检测成本提高，限制其在基层医疗单位，比如乡镇卫生院及资源匮乏地区的应用。此外，目前生物信息学人才的缺乏，面对海量信息的测序结果，难以短时间内得到正确可靠的分析结果，限制了测序技术在临床的推广。

3、链交换扩增(strand exchange amplification，sea)是一种简单的高灵敏性等温dna扩增技术，它与传统pcr扩增技术相似，但具有恒温低温扩增(设备需求：廉价水浴锅即可)、高灵敏性、高序列特异性、高保真性和样品需求量小等优势，使用一对引物(引物可修饰地高辛和生物素)和bst dna聚合酶，可检测特异性dna分子，并实现dna靶标的信号放大。该扩增技术主要依赖于dna双链在最适反应温度下通过碱基对局部打开产生单链变性气泡的动态解离方式，使核酸扩增引物入侵变性气泡，从而实现核酸的等温扩增(图1)。环介导等温扩增(lamp)、重组酶介导扩增(rpa)、依赖解旋酶扩增(hda)等技术，也是核酸等温扩增技术的重要补充，但由于这些检测技术需要设计多对引物(lamp技术)、或者反应依赖多种酶，比如rpa技术需要重组酶、单链dna结合蛋白和链置换dna聚合酶的参与、hda技术需要dna解旋酶、dna聚合酶、辅助蛋白和可选择的单链dna结合蛋白(ssb)等的参与，使这些技术的检测步骤变得复杂，因此检测成本有待降低。

4、核酸侧向流免疫层析分析法(nucleic acid lateral flow immunoassay,nalfia)，也称为免疫层析试纸条技术(immunochromatographic test strip,icts)，是一种将免疫技术、色谱层析技术和免疫标记技术相结合的固相膜免疫分析方法。通过将量子点荧光微球(qdfm)作为示踪剂，并将病原菌布鲁氏菌外膜蛋白omp28和omp22的单克隆抗体分别结合到硝酸纤维素膜上，可制作icts试纸条并进行布鲁氏菌病的早期筛查。此外，还有研究者通过胶体金免疫层析试纸条结合免疫磁分离技术，进行了肠道致病菌副溶血性弧菌的快速检测；利用胶体金试纸条，可定性检测耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(crkp)的碳青霉烯酶表型检测，以及进行大肠埃希菌o157：h7的快速检测，其灵敏度达104cuf/ml。胶体金是免疫层析法常用的一种标记物，目前应用广泛，但其灵敏度较其他免疫层析技术仍有一定差距，无法用于精确定量，且大多是定性检测，稳定性也有待提高。

5、通过在微孔膜固相载体上包被已知抗原/抗体以及高荧光强度，性能稳定的链霉亲和素修饰的聚苯乙烯纳米荧光微球(streptavidin-modified nanofluorescentpolystyrene microspheres，nfm@sa)(图2)，可以成功制作纳米荧光微球免疫层析试纸条(ficts)，并用于肺炎克雷伯菌等重要病原菌的快速多功能检测。在该技术中，聚苯乙烯纳米荧光微球作为一类特殊的纳米材料，具有良好的热稳定性、高荧光稳定性、高保真度和发光效率高等优点，可替代胶体金材料，作为分析标记物促进抗体的共价连接，并提高检测技术的灵敏度和特异性。在所制作的试纸条中，加样区加入核酸扩增产物(产物修饰有地高辛和生物素)，待测样本混合物通过毛细管作用穿过膜并到达试纸条上的检测线(t线)，此时，试纸条上的抗体或抗原能与检测线上包被的抗原或抗体结合，并通过荧光微球作为标记物定量标示反应结果。总之，链交换等温扩增与纳米荧光微球免疫层析技术(sea-ficts)相结合(图3)，可作为一种特异性强、灵敏度高的快速、廉价和定量检测方法，为肺炎等疾病的早期诊断提供新工具。

技术实现思路

1、基于上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种链交换等温扩增结合纳米荧光微球-免疫层析技术(sea-ficts)快速精准检测婴儿肺炎克雷伯菌新方法。

2、本发明的目的通过以下技术手段得以实现：

3、一方面，本发明提供一种链交换等温扩增结合纳米荧光微球-免疫层析技术快速精准检测婴儿肺炎克雷伯新的方法，该方法包括：

4、以肺炎克雷伯菌特异性靶基因mdh为靶标，进行寡核苷酸引物的设计与合成；

5、提取肺炎克雷伯菌基因组dna，利用上述引物进行sea等温扩增反应，获得扩增产物；

6、采用磁性纳米粒子对sea扩增产物进行纯化(图4)，去除假阳性结果；

7、最后采用纳米荧光微球免疫层析试纸条进行婴儿肺炎克雷伯菌快速定性、定量快速精准检测。

8、上述方法中，优选地，所述引物的序列如下：

9、上游引物：5’-cgttccgacctgtttaatgtg-3’(seq id no:1)

10、下游引物：5’-ggttcttcacgatacccgc-3’(seq id no:2)。

11、上述的引物序列的设计和合成具体如下：

12、(1)登录genbank，在核酸数据库中查询肺炎克雷伯菌标志性靶基因mdh基因的保守序列；

13、(2)应用primer premier 5.0软件、nupack网络软件对所得基因序列进行特异寡核苷酸引物的设计；

14、(3)并将所设计的候选序列递交到genbank进行blast比较，筛选出特异性较好的序列进行寡核苷酸引物的合成。

15、上述的方法中，优选地，所述sea扩增反应的反应液(青岛耐德生物技术有限公司)包括：

16、

17、

18、上述的方法中，优选地，所述sea扩增反应的反应条件为：60℃，30min。

19、上述的方法中，进行sea扩增前，所述引物用地高辛和生物素分别标记。

20、上述的方法中，优选地，采用磁性纳米粒子对sea扩增获得的样品产物进行纯化的具体步骤包括：

21、(1)取5μl的sea扩增的样品产物于样品管中，加入9μl的sea产物处理液，轻柔混匀5s，室温静置结合5min，期间颠倒混匀2次；

22、(2)接着将样品管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液；

23、(3)然后向样品管内慢慢加入200μl、85％乙醇，保持样品管于磁力架上2min，确保磁珠团始终被吸附在管壁上，吸弃废液；

24、(4)重复上述步骤(3)；

25、(5)将样品管于室温放置3～5min，至乙醇完全挥发；

26、(6)取下样品管，加入100μl的上样缓冲液pbs(ph 7.4)，充分混匀，室温放置5min，期间颠倒混匀2次；

27、(7)将样品管置于磁力架上进行磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，获得的纯化液保存备用。

28、上述的方法中，优选地，所述sea产物处理液为硅包被的磁性纳米粒子高盐悬浮溶液。购买于南京东纳生物科技有限公司核酸定量检测试剂盒。

29、上述的方法中，优选地，所述上样缓冲液为ph 7.4的pbs缓冲液。

30、上述的方法中，优选地，采用纳米微球免疫层析试纸条进行定量检测婴儿肺炎克雷伯菌基因的具体步骤包括：

31、(1)取出免疫层析试纸条卡，做好标记；

32、(2)将100μl的上样缓冲液(ph 7.4的pbs)垂直加入到检测卡上做空白对照，将100μl处理后的sea产物纯化液垂直滴加于加样孔，室温放置2min；

33、(3)进行免疫层析试纸条的上机检测定性和定量分析，记录数值，实现肺炎克雷伯菌基因的定性和定量检测。

34、上述的方法中，优选地，所述免疫层析试纸条卡的制备包括：

35、将样品垫用ph 7.4pbs缓冲液浸泡处理，置于干燥箱中干燥，2h后取出备用；将荧光微球-链霉亲和素溶液喷至nc膜上、抗地高辛抗体喷至检测线区(t线)，生物素-牛血清蛋白喷至质控线区(c线)，喷量为0.65ul/cm，37℃真空干燥过夜；之后将样本垫、nc膜、吸收垫等依次粘贴在pvc底板上，组装好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡，放入铝箔袋中，加入干燥剂密封保存备用。

36、上述的方法中，所述免疫层析试纸条检测原理为：

37、ficts包含6个部分：样品垫、nc膜、结合垫、检测线和控制线、背景垫和吸收垫(图5)。sea上样到试纸条加样孔(样品垫)后，标记的sea扩增子通过其一端标记的生物素与试纸条上的纳米荧光微球-链霉亲和素结合(nfm-sa)；通过其另一端标记的地高辛与t线区(检测线区)的抗地高辛抗体结合。生物素-牛血清蛋白固定在nc膜上作为c线区(控制线区)。

38、上述的方法中，优选地，进行免疫层析试纸条的上机检测定性和定量分析包括：

39、定性分析：用核酸荧光定量分析仪进行定性分析，t值＞500说明检测样本中有靶基因存在(根据t值大小判断其含量)，t值＜500则说明检测样本中无靶基因存在；

40、定量分析：用核酸荧光定量分析仪测量c值、t值的荧光值，以肺炎克雷伯菌不同dna浓度(或肺炎克雷伯菌浓度)为横坐标，t/c值为纵坐标绘制标准曲线，确定普通样品中肺炎克雷伯菌的数量。

41、本发明的有益效果：

42、本发明创新性地进行多学科交叉研究，将纳米荧光微球材料用于荧光侧向层析检测平台，结合链交换等温扩增等信号放大技术，大大提高了检测系统的灵敏度和特异性；检测新技术应用性强，傻瓜式操作、廉价易推广，可进行婴儿肺炎克雷伯菌等重要致病菌的快速精准检测，符合国家实际需求，具有产业化前景；通过磁珠与免疫层析试纸条结合，对纯化后的sea产物进行poct快速检测，在去除检测假阳性基础上，进一步提高检测技术的特异性、灵敏度和检测效率，所制作的便携式poct产品成本低，检测设备廉价小巧易携带，可应用于乡镇卫生院、村卫生室等基层医疗卫生单位，可弥补临床传统检测技术、基因芯片、荧光定量pcr、质谱以及拉曼光谱等方法的不足，为临床精准诊疗提供新方案。，相比现有技术而言还具备如下优点：

43、(1)低检测限及检测背景；

44、(2)高灵敏度，高序列特异性，不需要温控装置，恒温水浴锅即可；

45、(3)样本需求量小，有效节省临床稀缺样本；

46、(4)操作简便，不需要操作人员特殊培训，结果定量，易判读。