牛轮状病毒纯化浓缩方法及牛轮状病毒浓缩液与流程

本发明涉及病毒疫苗制备，尤其涉及一种牛轮状病毒纯化浓缩方法及牛轮状病毒浓缩液。

背景技术：

1、牛轮状病毒(bovine rotavirus,brv)是呼肠孤病毒科轮状病毒属a群轮状病毒，被广泛认为是造成犊牛月龄以下腹泻的最主要病原体之一。患病犊牛通常会在出生后7-30天发生严重水样腹泻，生长缓慢，体弱多病，严重的甚至会死亡。牛轮状病毒在全球腹泻样本中平均感染轮状病毒的概率为20-60％。目前尚无针对牛轮状病毒感染的有效治疗药物，主要依靠隔离感染犊牛、淘汰隐性感染动物控制牛轮状病毒的蔓延。但该病已经形成全球蔓延的趋势，一旦大规模爆发，势必会造不可估量的经济损失。

2、开发牛轮状病毒疫苗是有效遏制轮状病毒在畜间传播的有效且可靠手段。然而，现有技术对牛轮状病毒进行长时间的过滤浓缩纯化后，会出现病毒感染能力下降，制备成疫苗后免疫效果差等缺陷。因此，亟需寻找一种有效的方法对牛轮状病毒进行纯化和浓缩，以获得高抗原含量的疫苗，从而发挥更强的预防功效。

技术实现思路

1、有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明提供了一种牛轮状病毒纯化浓缩方法，通过依次对病毒液进行切向流过滤浓缩和peg浓缩，浓缩倍数可达10倍以上，抗原回收率高，蛋白去除率极佳，可制备出纯化牛轮状病毒抗原或为后续抗原进一步精细纯化提供原料。

2、本发明提供了一种牛轮状病毒纯化浓缩方法，依次对病毒液进行切向流过滤浓缩和peg浓缩，所述切向流过滤浓缩的过滤孔径为500-750kd，进口端压力≤0.1mpa，跨膜压力≤0.1mpa；所述peg浓缩使用的peg分子量为3600-8800。

3、优选的，所述切向流过滤浓缩的操作步骤中包括洗滤；所述洗滤的试剂为0.015-0.025mol/l的pbs溶液；

4、优选的，所述pbs溶液的ph值为7.0-7.4。

5、优选的，所述切向流过滤浓缩的浓缩倍数为5-20倍。

6、优选的，所述切向流过滤浓缩的蛋白去除率≥93％；

7、和/或，当所述切向流过滤浓缩前的病毒液中抗原含量≤107.5tcid50/ml，蛋白含量≥7.5mg/ml时，所述切向流过滤浓缩后的病毒液中抗原含量≥108.5tcid50/ml，蛋白含量≤5.3mg/ml。

8、优选的，所述peg浓缩的操作步骤中包括将peg与所述切向流过滤浓缩后的病毒液混合的步骤；所述peg与所述切向流过滤浓缩后的病毒液混合后，peg的终浓度为8％-16％vol。

9、优选的，所述切向流过滤浓缩和peg浓缩的综合蛋白去除率≥96％；

10、和/或，当所述切向流过滤浓缩前的病毒液中抗原含量≤107.5tcid50/ml，蛋白含量≥7.5mg/ml时，所述peg浓缩后的病毒液中抗原含量≥108.5tcid50/ml，蛋白含量≤2.8mg/ml。

11、优选的，所述病毒液由病毒培养液经离心、滤过处理，得到；所述滤过处理的孔径为0.2-0.5μm；

12、优选的，所述离心的转速为6000-8000r/min；所述离心的时间为20-40min。

13、优选的，所述病毒培养液在离心前经快速解冻处理，所述快速解冻的温度≤37℃；所述快速解冻的时间≤4h。

14、本发明还提供了一种牛轮状病毒浓缩液，所述牛轮状病毒浓缩液由上述牛轮状病毒纯化浓缩方法制备得到。

15、有益效果：

16、本发明提供了一种牛轮状病毒纯化浓缩方法，通过依次对病毒液进行切向流过滤浓缩和peg浓缩，浓缩倍数可达10倍以上，抗原回收率达到100％，且蛋白去除率达到96％以上。经实验验证：本发明所述牛轮状病毒纯化浓缩方法得到的浓缩液具有良好的免疫原性，且免疫后副反应几率低。

17、本发明所述牛轮状病毒纯化浓缩方法可用于活病毒和灭活病毒的纯化浓缩，其可制备出纯化牛轮状病毒抗原，能为后续抗原的进一步精细纯化提供原料。

技术特征：

1.牛轮状病毒纯化浓缩方法，其特征在于，依次对病毒液进行切向流过滤浓缩和peg浓缩；所述切向流过滤浓缩的过滤孔径为500-750kd，进口端压力≤0.1mpa，跨膜压力≤0.1mpa；所述peg浓缩使用的peg分子量为3600-8800。

2.根据权利要求1所述牛轮状病毒纯化浓缩方法，其特征在于，所述切向流过滤浓缩的操作步骤中包括洗滤；所述洗滤的试剂为0.015-0.025mol/l的pbs溶液；

3.根据权利要求1或2所述牛轮状病毒纯化浓缩方法，其特征在于，所述切向流过滤浓缩的浓缩倍数为5-20倍。

4.根据权利要求1-3任意一项所述牛轮状病毒纯化浓缩方法，其特征在于，所述切向流过滤浓缩的蛋白去除率≥93％；

5.根据权利要求1-3任意一项所述牛轮状病毒纯化浓缩方法，其特征在于，所述peg浓缩的操作步骤中包括将peg与所述切向流过滤浓缩后的病毒液混合的步骤；所述peg与所述切向流过滤浓缩后的病毒液混合后，peg的终浓度为8％-16％vol。

6.根据权利要求1-5任意一项所述牛轮状病毒纯化浓缩方法，其特征在于，所述切向流过滤浓缩和peg浓缩的综合蛋白去除率≥96％；

7.根据权利要求1-6任意一项所述牛轮状病毒纯化浓缩方法，其特征在于，所述病毒液由病毒培养液经离心、滤过处理，得到；所述滤过处理的孔径为0.2-0.5μm。

8.根据权利要求7所述牛轮状病毒纯化浓缩方法，其特征在于，所述离心的转速为6000-8000r/min；所述离心的时间为20-40min。

9.根据权利要求7或8所述牛轮状病毒纯化浓缩方法，其特征在于，所述病毒培养液在离心前经快速解冻处理，所述快速解冻的温度≤37℃；所述快速解冻的时间≤4h。

10.牛轮状病毒浓缩液，其特征在于，所述牛轮状病毒浓缩液由权利要求1-9任意一项所述牛轮状病毒纯化浓缩方法制备得到。

技术总结
本发明涉及病毒疫苗制备技术领域，尤其涉及一种牛轮状病毒纯化浓缩方法及牛轮状病毒浓缩液。所述牛轮状病毒纯化浓缩方法通过依次对病毒液进行切向流过滤浓缩和PEG浓缩，浓缩倍数可达10倍以上，抗原回收率达到100％，且蛋白去除率达到96％以上。本发明所述牛轮状病毒纯化浓缩方法得到的浓缩液具有良好的免疫原性，且免疫后副反应几率低。本发明所述牛轮状病毒纯化浓缩方法可用于活病毒和灭活病毒的纯化浓缩，其可制备出纯化牛轮状病毒抗原，能为后续抗原的进一步精细纯化提供原料。

技术研发人员：王秉昆,陈坚,杨青春,宋志刚,泰鹏,包文明,李超,李晓艳,齐志涛,贺瑶,王岩,张静,吉格木德
受保护的技术使用者：金宇保灵生物药品有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12