一种牙周炎生物膜唾液接种物的保存方法

：本发明涉及微生物，具体涉及一种牙周炎生物膜唾液接种物的保存方法。

背景技术

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背景技术：

1、牙周炎是人类最普遍的疾病之一，目前影响着全球约5.38亿人。牙周炎由口腔生物膜失调引起，因此，建立合适的生物膜模型是非常必要的。接种源是建立口腔生物膜模型的一个关键因素，在真实的口腔环境中，生物膜通常不是特定菌株作用的结果，而是不同微生物相互协作、竞争和代谢所形成的，因此，多物种模型比单一物种更具有优势，目前已知的牙周炎生物膜的研究常用唾液或龈下菌斑作为接种源。作为接种源的唾液或龈下菌斑的存活生物量以及存活种类，特别是与牙周炎疾病相关的特定菌群的存活，对于能否成功构建牙周炎生物膜起到关键作用。

2、疾病状态下的唾液菌群与健康状态下的唾液菌群最大的不同是含有更多的厌氧菌，在构建牙周炎生物膜模型时通常采样后30min内处理唾液，进行生物膜的培养，试验前处理时间较短。市面上有不同种类的唾液保存液，但其保存液仅可减少唾液中生物遗传物质的降解，不会使唾液中菌群长时间存活。

3、目前为了满足构建牙周炎生物膜的需要，在不影响唾液中存活生物量以及细菌存活种类的情况下，给试验处理唾液预留出更多的时间，需要一种可以保存牙周炎生物膜唾液接种物的的方法。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的是克服构建牙周炎生物膜模型时处理唾液时间短，用于接种的唾液保存时间短的不足之处，提供一种保存牙周炎生物膜唾液接种物的的方法。

2、本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

3、一种保存牙周炎生物膜唾液接种物的的方法，包括如下步骤：

4、采集唾液前24小时，牙周炎受试者不进行任何口腔卫生，前2小时不吃任何食物、喝任何饮料。整个唾液采集过程在冰上进行。每个志愿者将10ml未受刺激的全唾液使用漏斗直接排入15ml的无菌冷冻管中，结束后快速将无菌冷冻管的盖子拧上。在超净台中拧开盖子，加入1ml矿物油，注意不要将矿物油和唾液混合，矿物油在唾液上层，迅速拧上盖子。将冷冻管放入2.5l圆底立式厌氧培养袋中，撕开2.5l厌氧产气包的外包装袋，放入2.5l厌氧产气包，沿培养袋密封处折叠两圈，再用夹子固定；

5、收集所有样品后，将厌氧袋放入4℃冰箱中保存，用于后续唾液接种物评价及接种牙周炎生物膜培养。

6、进一步地，所述漏斗及15ml冷冻管使用前在121℃进行蒸汽高压灭菌15分钟。

7、进一步地，所述矿物油使用前，在121℃进行蒸汽高压灭菌15分钟，随后在超净台进行分装。

8、进一步地，牙周炎受试者在无菌室使用漏斗将10ml唾液排入15ml无菌冷冻管中，迅速拧上盖子，放在冰上。

9、进一步地，将无菌冷冻管在超净台打开，慢慢加入1ml灭过菌分装好的矿物油，注意矿物油不要和唾液混合，在唾液上层，拧上盖子。

10、进一步地，将油封后装有唾液的无菌冷冻管放入2.5l圆底立式厌氧培养袋中，撕开2.5l厌氧产气包的外包装袋，放入2.5l厌氧产气包，沿培养袋密封处折叠两圈，再用夹子固定。

11、有益效果：

12、1、本发明方法中采集唾液后延长了唾液接种物中菌的存活时间，特别是厌氧菌的存活，有效延长构建牙周炎生物膜时处理唾液的时间，适合保存牙周炎生物膜唾液接种物使用。同时，本发明方法保存的唾液不会受矿物油影响，后续可达到接种物评价要求。

13、2、本发明方法建立了牙周炎生物膜唾液接种物的保存方法，弥补了此方法的空缺。

14、3、本发明所采用的材料价格低廉易得，且该方法简洁高效。

15、说明书附图：

16、图1本发明中保存的唾液样本dna 16s通用引物扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图

17、其中：1为实施例1(保存0小时)pcr扩增产物条带，2是实施例2(4℃保存4小时)pcr扩增产物条带，3是实施例3(4℃保存4小时，甘油一80℃保存24小时)pcr扩增产物条带，4是对照例1(现采集新鲜唾液)pcr扩增产物条带；

18、图2本发明中保存的唾液样本dna普氏菌属扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图

19、其中：1为实施例1(保存0小时)pcr扩增产物条带，2是实施例2(4℃保存4小时)pcr扩增产物条带，3是实施例3(4℃保存4小时，甘油-80℃保存24小时)pcr扩增产物条带，4是对照例1(现采集新鲜唾液)pcr扩增产物条带；

20、图3本发明中保存的唾液样本dna梭杆菌属扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图

21、其中：1为实施例1(保存0小时)pcr扩增产物条带，2是实施例2(4℃保存4小时)pcr扩增产物条带，3是实施例3(4℃保存4小时，甘油-80℃保存24小时)pcr扩增产物条带，4是对照例1(现采集新鲜唾液)pcr扩增产物条带；

22、图4本发明中保存的唾液样本dna密螺旋体菌属扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图

23、其中：1为实施例1(保存0小时)pcr扩增产物条带，2是实施例2(4℃保存4小时)pcr扩增产物条带，3是实施例3(4℃保存4小时，甘油-80℃保存24小时)pcr扩增产物条带，4是对照例1(现采集新鲜唾液)pcr扩增产物条带；

24、图5本发明中保存的唾液样本dna卟啉单胞菌属扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图

25、其中：1为实施例1(保存0小时)pcr扩增产物条带，2是实施例2(4℃保存4小时)pcr扩增产物条带，3是实施例3(4℃保存4小时，甘油-80℃保存24小时)pcr扩增产物条带，4是对照例1(现采集新鲜唾液)pcr扩增产物条带；

26、图6本发明中保存的唾液样本dna tannerella菌属扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图

27、其中：1为实施例1(保存0小时)pcr扩增产物条带，2是实施例2(4℃保存4小时)pcr扩增产物条带，3是实施例3(4℃保存4小时，甘油-80℃保存24小时)pcr扩增产物条带，4是对照例1(现采集新鲜唾液)pcr扩增产物条带；

28、图7实时荧光定量pcr ct值一般柱形图

技术特征：

1.一种牙周炎生物膜唾液接种物的保存方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的牙周炎生物膜唾液接种物的保存方法，其特征在于：所述漏斗及15ml冷冻管使用前在121℃进行蒸汽高压灭菌15分钟。

3.根据权利要求1所述的牙周炎生物膜唾液接种物的保存方法，其特征在于：所述矿物油使用前，在121℃进行蒸汽高压灭菌15分钟，随后在超净台进行分装。

4.根据权利要求1所述的牙周炎生物膜唾液接种物的保存方法，其特征在于：牙周炎受试者在无菌室使用漏斗将10ml唾液排入15ml无菌冷冻管中，迅速拧上盖子，放在冰上。

5.根据权利要求1所述的牙周炎生物膜唾液接种物的保存方法，其特征在于：将无菌冷冻管在超净台打开，缓慢加入1ml灭过菌分装好的矿物油，注意矿物油不要和唾液混合，在唾液上层，拧上盖子。

6.根据权利要求1所述的牙周炎生物膜唾液接种物的保存方法，其特征在于，将油封后装有唾液的无菌冷冻管放入2.5l圆底立式厌氧培养袋中，撕开2.5l厌氧产气包的外包装袋，放入2.5l厌氧产气包，沿培养袋密封处折叠两圈，再用夹子固定。

技术总结
本发明公开了一种牙周炎生物膜唾液接种物的保存方法，包括如下步骤：采集唾液前24小时，受试者不进行任何口腔卫生，前2小时不进食、不喝饮料。每个受试者将10ml未受刺激的全唾液使用漏斗排入15ml无菌冷冻管，插入冰中。在超净台中加入1ml矿物油，注意不要吹吸，矿物油在唾液上层。将冷冻管放入2.5L圆底立式厌氧培养袋中，撕开2.5L厌氧产气包的外包装袋，放入厌氧产气包，沿培养袋密封处折叠两圈，再用夹子固定，放入4℃冰箱中保存，用于后续唾液接种物评价及接种牙周炎生物膜培养。本发明方法中延长了唾液接种物中菌的存活时间，特别是厌氧菌的存活时间，有效延长保存唾液的时间，适合保存牙周炎生物膜唾液接种物使用。

技术研发人员：赵化冰,谭有兰,韩照莹
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13