一种制备玉米抗性淀粉的III型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用

本发明涉及生物酶工程和基因工程领域，特别是涉及一种制备玉米抗性淀粉的iii型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、抗性淀粉(resistant starch，rs)作为一种新型膳食纤维，不能被人体胃和小肠消化吸收，但可进入结肠中被肠道菌群发酵利用，进而发挥其降血糖、降血脂、预防心血管疾病和结肠癌等多种生理功效。根据来源、结构、消化特性和应用的不同，rs可分为5类：rs1型抗性淀粉(物理包埋淀粉)、rs2型抗性淀粉(抗性淀粉颗粒)、rs3型抗性淀粉(老化回生淀粉)、rs4型抗性淀粉(化学改性淀粉)、rs5型抗性淀粉(淀粉-脂质复合物)。rs3型抗性淀粉是膳食中抗性淀粉的主要组成部分，对人体具有重要的生理功能。作为一种新型的功能性食品原料，rs3型抗性淀粉制备方法的研究成为近年来碳水化合物科学的热点课题。

2、近年来，研究者针对不同淀粉原料，采取不同制备方法，以获得高含量rs3型抗性淀粉产品。不同处理方法、条件参数等对rs3型抗性淀粉制备时的得率有不同程度的影响。在rs3型抗性淀粉的制备过程中，影响抗性淀粉产率的一个重要因素是淀粉中直链淀粉含量。由于淀粉中的直链淀粉分子比支链淀粉分子更易老化，分子之间很容易产生有序的排列形成抗性淀粉；二者的比率越大，抗性淀粉含量越高。从这一角度考虑，高直链玉米淀粉在制备rs3型抗性淀粉时具有明显的原料优势。由于国内还没有高直链玉米淀粉的大规模种植生产，售价较高，并且在以高直链玉米淀粉制备rs3型抗性淀粉的过程中需要通过反复高温处理后得到，这种原料和加工条件均增加了产品的成本，因此亟需开发一种以普通玉米淀粉(低直链玉米淀粉)为原料制备高含量rs3型抗性淀粉的方法。

3、rs3型抗性淀粉的制备通常是采用热处理法和脱支法，或者二者相结合的方法。淀粉在受热糊化过程中，淀粉颗粒吸水膨胀破裂释放出直链淀粉，随后降温凝沉，长链聚合物间通过双螺旋叠加形成抗性淀粉。在rs3型抗性淀粉的制备过程中，现有的脱支法有两种，即酸法脱支和酶法脱支。酸法脱支是用酸处理淀粉，但其脱支效果和安全性不及酶法脱支效果好，并且酸对设备的高腐蚀性是实际生产必需考虑的技术问题；酶法脱支制备抗性淀粉可使制备过程中化学试剂的使用量大大降低，提高抗性淀粉的品质，减少对环境的污染，但是存在着酶解时间长、抗性淀粉制备得率不高的弊端。目前已报道的以普通玉米淀粉为原料，利用热处理法和酶法脱支相结合的方法制备玉米抗性淀粉的最高得率为58.87％。zhang等以10％普通玉米淀粉乳为原料，将玉米淀粉乳于80℃下处理20min后，在温度90℃、ph值5.5的条件下添加4.0u/gα-淀粉酶，水解15min后，再用普鲁兰酶连续处理(添加酶量为12.8u/g、反应时间为32h、反应温度为46.2℃，ph值为5.0)，制备得到抗性淀粉含量为58.87％的rs3型抗性淀粉产品。即在玉米淀粉糊化时加入嗜热α-淀粉酶处理，α-淀粉酶作用于淀粉中α-1,4-糖苷键，改变淀粉的链长与结构；再加入普鲁兰酶，其作用于α-1,6-糖苷键从而使淀粉水解产物中含有更多的游离直链淀粉分子；该反应体系在低温下凝沉，不同的直链淀粉分子间通过氢键形成双螺旋，最后获得rs3型抗性淀粉。嗜热酸性iii型普鲁兰水解酶tk-pul可同时水解淀粉中α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键。将tk-pul应用于rs3型抗性淀粉的制备，可同时发挥嗜热α-淀粉酶和普鲁兰酶的功能，通过对反应条件的选择和控制，简化rs3型抗性淀粉的制备流程、缩短酶解时间、提高制备效率。因此开发酶解效率高、抗性淀粉制备得率高的iii型普鲁兰水解酶tk-pul突变体对于抗性淀粉制备工艺的提升具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种制备玉米抗性淀粉的iii型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明制备得到的iii型普鲁兰水解酶突变体，酶活力高，利用该突变体制备玉米抗性淀粉，可以有效提高制备得率。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种制备玉米抗性淀粉的iii型普鲁兰水解酶突变体，所述iii型普鲁兰水解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明还提供一种编码上述的iii型普鲁兰水解酶突变体的编码基因。

5、进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、本发明还提供一种重组载体，包括上述的编码基因。

7、本发明还提供一种重组微生物菌株，包括上述的重组载体。

8、本发明还提供上述的编码基因、重组载体或重组微生物菌株在制备iii型普鲁兰水解酶突变体中的应用。

9、本发明还提供上述的iii型普鲁兰水解酶突变体在制备玉米抗性淀粉中的应用。

10、本发明公开了以下技术效果：

11、为了获得高效制备玉米抗性淀粉的iii型普鲁兰水解酶突变体，本发明对iii型普鲁兰水解酶tk-pul中邻近催化活性中心的第500位异亮氨酸(i)以及第538位亮氨酸(l)进行饱和突变(将tk-pul中第500位异亮氨酸突变为谷氨酸，将第538位亮氨酸突变为天冬氨酸)，构建相应的饱和突变体文库。通过初步比较重组酶以普通玉米淀粉为底物的比活力，并进一步比较重组酶以普通玉米淀粉为原料的玉米抗性淀粉制备得率，筛选出玉米抗性淀粉制备得率显著提高的iii型普鲁兰水解酶突变体tp-i500e/l538d。

12、本发明提供的iii型普鲁兰水解酶突变体tp-i500e/l538d对普通玉米淀粉的比活力由对照(突变前)的48.08u/mg提高到133.66u/mg，提高了1.78倍。利用iii型普鲁兰水解酶tk-pul和突变体tp-i500e/l538d制备玉米抗性淀粉的工艺条件如下：普通玉米淀粉乳浓度为15％、iii型普鲁兰水解酶加酶量为15u/g玉米淀粉、反应时间为12h、反应温度为80℃、ph值为5.0。在此制备条件下，iii型普鲁兰水解酶突变体tp-i500e/l538d的玉米抗性淀粉制备得率由对照(突变前)的30.87％提高到59.15％，提高了0.92倍。

技术特征：

1.一种制备玉米抗性淀粉的iii型普鲁兰水解酶突变体，其特征在于，所述iii型普鲁兰水解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.一种编码如权利要求1所述的iii型普鲁兰水解酶突变体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq idno.2所示。

4.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求2或3所述的编码基因。

5.一种重组微生物菌株，其特征在于，包括权利要求4所述的重组载体。

6.一种如权利要求2或3所述的编码基因、如权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组微生物菌株在制备iii型普鲁兰水解酶突变体中的应用。

7.一种如权利要求1所述的iii型普鲁兰水解酶突变体在制备玉米抗性淀粉中的应用。

技术总结
本发明公开了一种制备玉米抗性淀粉的III型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用，涉及生物酶工程和基因工程领域。所述III型普鲁兰水解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明对III型普鲁兰水解酶TK‑PUL中邻近催化活性中心的第500位异亮氨酸以及第538位亮氨酸进行饱和突变，构建得到了氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的III型普鲁兰水解酶突变体。本发明提供的突变型III型普鲁兰水解酶突变体对普通玉米淀粉的比活力由突变前的48.08U/mg提高到133.66U/mg，利用该III型普鲁兰水解酶突变体制备玉米抗性淀粉的制备得率由突变前的30.87％提高到59.15％。

技术研发人员：曾静,何础阔,袁林,郭建军,王通,聂俊辉
受保护的技术使用者：江西省科学院微生物研究所（江西省流域生态研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11