具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用

本发明属于生物工程领域，具体涉及具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、纤维素是地球上最丰富的自然资源，在生物炼制中起着举足轻重的作用，其在生物利用之前，需要通过纤维素酶系将其分解成易于降解的寡糖或单糖。然而，由于其顽固的结晶结构使其难以被高效水解。因此，提高酶的催化效率和降低水解酶的成本是酶工业应用的主要挑战。

2、葡聚糖单加氧酶(lpmos)通过氧化断裂糖苷键的方式作用于纤维素表面顽固的结晶区，与传统的纤维素酶同时降解底物时，能够显著促进纤维素酶对底物的催化效率，是一类非常具有应用前景的生物质降解辅助酶。正因如此，lpmos的发现对于纤维素的生物质降解具有重要意义。但大部分葡聚糖单加氧酶在高温长时间保温后极易失活，影响其实际应用效果。为了提高酶的热稳定性，科研工作者提出了许多非常重要的策略，如随机突变、直接进化筛选、构建嵌合体、化学修饰等方法，但其普遍存在构建繁琐、成功率低、工作量大、成本高、周期长等问题。此外，现有方法在提高酶热稳定性的同时，往往会降低酶的活性。因此，研究开发同时兼具高酶活性以及高热稳定性的葡聚糖单加氧酶对于扩展该酶在工业化生产中的应用尤为重要。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具有高活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用。本发明通过定点突变改造了来自解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)菌株产生的葡聚糖单加氧酶

2、balpmo10a(genbank:aap57758.1)的氨基酸序列，显著提高了酶活以及热稳定性，使其具有更好的实际应用价值。

3、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

4、本发明的第一个方面，提供了具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶，本发明的葡聚糖单加氧酶是通过对解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)菌株产生的葡聚糖单加氧酶balpmo10a(genbank:aap57758.1)进行改造获得的，所述改造具体为在葡聚糖单加氧酶balpmo10a氨基酸序列中的第3、4、5、36、40、55或124位中的一位或两位进行氨基酸替换获得；

5、一位氨基酸替换为n36e、r55q、v40a、v40i、k5e、v40m、e124d、y3f、i4v、v40l中的一种；

6、两位氨基酸替换为v40i-n36e、i4v-n36e、e124d-r55q、y3f-r55q、v40l-r55q、v40l-n36e、e124d-y3f、v40l-i4v、v40l-y3f、i4v-e124d、v40l-e124d中的一种。

7、优选的，所述葡聚糖单加氧酶的氨基酸序列为seq id no.1-seq id no.21的一种。本发明的葡聚糖单加氧酶通过对原有葡聚糖单加氧酶balpmo10a的氨基酸进行定点突变，有效地提高了酶的活性以及热稳定性。

8、本发明的第二个方面，提供一种葡聚糖单加氧酶类似物，其具有与所述葡聚糖单加氧酶相同的生物活性，所述葡聚糖单加氧酶类似物是指在用所述葡聚糖单加氧酶和另一种化合物融合或者用所述葡聚糖单加氧酶的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。

9、本发明的第三个方面，提供一种葡聚糖单加氧酶衍生物，其氨基酸序列具有与所述葡聚糖单加氧酶氨基酸主序列≥70％的一致性，≥90％的相似性，该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述葡聚糖单加氧酶具有同样生物活性的葡聚糖单加氧酶。

10、本发明的第四个方面，提供一种葡聚糖单加氧酶变体，其氨基酸序列具有与权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶氨基酸主序列≥70％的一致性，≥90％的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸，所述葡聚糖单加氧酶变体具有与上述葡聚糖单加氧酶相同的生物活性。

11、本发明的第五个方面，提供所述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶衍生物或葡聚糖单加氧酶变体的核苷酸，其包含下组中的任一种：

12、(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽或类似物、衍生物或其变体的核苷酸；

13、(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；

14、(c)与(a)或(b)中所述核苷酸有≥75％一致性的核苷酸。

15、本发明的第六个方面，提供上述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶衍生物或葡聚糖单加氧酶变体的制备方法，所述制备方法包括通过基因由基因工程菌生产而得。

16、进一步的，所述制备方法包括：

17、合成编码所述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶或葡聚糖单加氧酶变体的核苷酸；

18、将核苷酸导入表达载体构建表达载体，然后导入宿主进行培养，收集，纯化即得。

19、本发明的第七个方面，提供上述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶衍生物或葡聚糖单加氧酶变体在食品、饲料、能源、生物转化领域中的应用。

20、本发明的有益效果为：

21、本发明通过对葡聚糖单加氧酶balpmo10a(genbank:aap57758.1)的基因序列进行定点突变，改变其氨基酸序列，从而显著提高了葡聚糖单加氧酶的酶活性以及热稳定性。经试验验证，本发明改造后的葡聚糖单加氧酶与野生型(wt)酶相比，单突变体对可溶底物2,6-dmp酶活性增加了40％-90％，双突变体酶对可溶底物2,6-dmp活性增加了30％-95％(图1)；突变体在不同温度下与来自里氏木霉纤维素酶的协同效应产生的还原糖都显著高于野生型(图10)；突变体表现出较高的表观熔化温度值(tm)(图11和表1)，比wt更稳定。本发明改造后的葡聚糖单加氧酶更加适合产业化生产特别是高温环境下工业化生产的需求，有利于提高反应催化效率，缩短生产时间成本，因此具有良好的实际应用价值。

22、本发明通过多序列比对后进行定点突变在改善lpmos方面是有效的，证明通过半理性设计的蛋白质工程方法来提高酶活性和稳定性将是蛋白质工程在各种工业应用不可或缺的途径之一。

技术特征：

1.具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶，其特征在于，所述葡聚糖单加氧酶是通过对balpmo10a酶的氨基酸序列中的第3、4、5、36、40、55或124位中的一个或两个进行氨基酸替换获得；

2.如权利要求1所述葡聚糖单加氧酶，其特征在于，葡聚糖单加氧酶的氨基酸序列为seq id no.1-seq id no.21中的一种。

3.一种葡聚糖单加氧酶类似物，其特征在于，其具有与权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶相同的生物活性，所述葡聚糖单加氧酶类似物是指在用所述葡聚糖单加氧酶和另一种化合物融合或者用所述葡聚糖单加氧酶的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。

4.一种葡聚糖单加氧酶衍生物，其特征在于，其氨基酸序列具有与权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶氨基酸主序列≥70％的一致性，≥90％的相似性，该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述葡聚糖单加氧酶具有同样生物活性的葡聚糖单加氧酶。

5.一种葡聚糖单加氧酶变体，其特征在于，其氨基酸序列具有与权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶氨基酸主序列≥70％的一致性，≥90％的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸，所述葡聚糖单加氧酶变体具有与上述葡聚糖单加氧酶相同的生物活性。

6.编码权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶、权利要求3所述葡聚糖单加氧酶类似物、权利要求4所述葡聚糖单加氧酶衍生物或权利要求5所述葡聚糖单加氧酶变体的核苷酸；优选的，其包含下组中的任一种：

7.权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶、权利要求3所述葡聚糖单加氧酶类似物、权利要求4所述葡聚糖单加氧酶衍生物或权利要求5所述葡聚糖单加氧酶变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括通过基因由基因工程菌生产而得。

8.如权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述方法至少包括：

9.权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶、权利要求3所述葡聚糖单加氧酶类似物、权利要求4所述葡聚糖单加氧酶衍生物或权利要求5所述葡聚糖单加氧酶变体在食品、饲料、能源、生物转化领域中的应用；

10.如权利要求9所述应用，其特征在于，权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶、权利要求3所述葡聚糖单加氧酶类似物、权利要求4所述葡聚糖单加氧酶衍生物或权利要求5所述葡聚糖单加氧酶变体在降解纤维素或木质纤维素中的应用；

技术总结
本发明公开了具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用，属于生物工程领域，本发明对葡聚糖单加氧酶BaLPMO10A的氨基酸序列进行定点突变，改变其氨基酸序列，显著提高葡聚糖单加氧酶的酶活性以及热稳定性。经验证，改造后的葡聚糖单加氧酶与野生型酶相比，单突变体对2,‑6‑DMP酶活性增加了40％‑90％，双突变体增加了30％‑95％；对PASC的催化水解活性增加了1倍；协同里氏木霉商业纤维素酶系降解底物PASC、FP和Avicel的还原糖产量分别增加了2.7倍、2.0倍和1.9倍；Tm升高了7.5℃，其为纤维素降解提供了更好的工具，因此更加适合产业化生产，具有良好的实际应用价值。

技术研发人员：姚礼山,梅硕·哈杜什·贝赫,宋乡飞,王梦婷
受保护的技术使用者：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12