甲基化位点作为子宫内膜异位症分子诊断标志物的应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及甲基化位点作为子宫内膜异位症分子诊断标志物的应用。

背景技术：

1、子宫内膜异位症是一种慢性妇科疾病，表现为子宫内膜样组织生长于宫腔外的组织器官上。以为子宫内膜组织受激素调节呈月经周期性的增殖和脱落，从而引起局部炎症和疼痛甚至降低孕龄期患者的受孕率。受限于现有的诊断方法，子宫内膜异位症患者往往得不到及时的诊断，从而严重影响患者给治疗和康复。现有影像学的检查手段对微小的病灶检出率低，甚至会出现漏诊和误诊。现有的和已报道的子宫内膜异位症相关标记物对于子宫内膜异位症诊断的灵敏度和特异性均不理想，如ca125、pgp9.5、p450和尿液vdbp等。因此，急需适于子宫内膜异位症的高灵敏度和高特异性的生物学诊断标记物。

2、dna的甲基化修饰是疾病发生的早期事件之一，它能通过引起染色体构象改变来抑制基因的表达，从而疾病的发生和进展。有报道指出，异位子宫内膜组织存在异常的dna甲基化修饰，如gata6、gata2和hoxa10等基因的启动子区和编码区。这些异常修饰的甲基化位点具备较好的特异性并且甲基化位点的甲基化率也能用荧光定量pcr(qpcr)或数字pcr(ddpcr)的手段进行检测。因此，子宫内膜异位症的甲基化位点具备作为疾病诊断标记物的潜力。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供定量检测chr4：6318317甲基化作为生物标志物在制备诊断子宫内膜异位症和/或子宫腺肌症的产品中的应用。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一方面，提供定量检测chr4：6318317甲基化水平的试剂在制备诊断子宫内膜异位症和/或子宫腺肌症的产品中的应用。

4、在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括通过甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法中的至少一种方法检测chr4：6318317甲基化水平的试剂。

5、在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括引物、探针。

6、在本发明的一些实施方式中，所述引物的序列包括：

7、primers f：5’-gttatagtgttaggtggaa-3’；

8、primers r：5’-catattctcttatctctataca-3’。

9、在本发明的一些实施方式中，所述探针的序列包括：

10、probes m：5’-gtttttaaaattcggataatgga-3’；

11、probes nm：5’-gtttttaaaatttggataatgga-3’。

12、在本发明的一些实施方式中，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，所述探针的3’端连接有淬灭基团。

13、在本发明的一些优选实施方式中，所述报告基团选自fam、rox、vic、hex、tet、joe、ned、cy5、cy3。

14、在本发明的一些优选实施方式中，所述淬灭基团选自bqh1、bhq2、bhq3、tamara、nfq-mgb。

15、在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。

16、本发明的第二方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述的定量检测chr4：6318317甲基化水平的试剂。

17、在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。

18、本发明的第三方面，提供一种用于诊断或辅助诊断子宫内膜异位症和/或子宫腺肌症的系统，包括：

19、检测模块，用于检测样本中chr4：6318317甲基化水平；

20、分析模块：用于获取上述检测结果，根据预定规则判断诊断结果。

21、在本发明的一些实施方式中，所述预定规则为：当检测到cchr4：6318317甲基化水平低于正常样本，则判断为子宫内膜异位症和/或子宫腺肌症高风险。

22、本发明的第四方面，提供一种非诊断目的chr4：6318317甲基化水平的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

23、s1、提取dna样本，并对所述的dna样本进行亚硫酸盐处理；

24、s2、用本发明第一方面所述的引物和探针扩增亚硫酸盐处理后的样品，获取样品中的chr4：6318317甲基化水平。

25、本发明的有益效果是：

26、本发明通过dna甲基化高通量测序技术对卵巢异位子宫内膜组织和在位子宫内膜组织进行甲基化的高通量检测，对比分后寻筛选得到了具备高特异性和高灵敏度的甲基化位点(chr4：6318317)，为dna片段上的1个cpg位点，此位点为基因间的序列(intergenic)，可以作为子宫内膜异位症诊断的生物标记物，目前未见报道。发明人针对这一位点设计了探针，使用ddpcr技术检测该位点在卵巢异位子宫内膜组织、在位子宫内膜组织和子宫腺肌症组织中的甲基化率，并进行了生物学统计分析。结果显示，可以通过检测这个cpg位点的甲基化水平诊断子宫内膜异位症，同时还能区分不同子宫内膜异位症疾病类型。具体表现为子宫内膜异位症患者的异位病灶组织chr4：6318317的甲基化率低于在位子宫内膜组织，并且卵巢子宫内膜异位症患者的异位病灶组织chr4：6318317的甲基化率低于腺肌症患者的异位病灶组织。通过roc曲线分析发现具有非常高特异性和敏感性，具有诊断价值。

技术特征：

1.定量检测chr4：6318317甲基化水平的试剂在制备诊断子宫内膜异位症和/或子宫腺肌症的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法中的至少一种方法检测chr4：6318317甲基化水平的试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括引物、探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引物的序列包括：

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述探针的序列包括：

6.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。

7.一种产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1～5任一项所述的试剂。

8.一种用于诊断或辅助诊断子宫内膜异位症和/或子宫腺肌症的系统，其特征在于，包括：

9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述预定规则为：当检测到cchr4：6318317甲基化水平低于正常样本，则判断为子宫内膜异位症和/或子宫腺肌症高风险。

10.一种非诊断目的chr4：6318317甲基化水平的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了甲基化位点作为子宫内膜异位症分子诊断标志物的应用。本发明发现了用于子宫内膜异位症诊断的生物标记物，该标记物为DNA片段上的1个CpG位点，该甲基化标记物的位点为：chr4：6318317；可以通过检测这个CpG位点的甲基化水平诊断子宫内膜异位症，同时还能区分不同子宫内膜异位症疾病类型。具体表现为子宫内膜异位症患者的异位病灶组织chr4：6318317的甲基化率低于在位子宫内膜组织，并且卵巢子宫内膜异位症患者的异位病灶组织chr4：6318317的甲基化率低于腺肌症患者的异位病灶组织。通过ROC曲线分析发现具有非常高特异性和敏感性，具有诊断价值。

技术研发人员：喻梅星
受保护的技术使用者：广州市妇女儿童医疗中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12