一种与虹鳟热应激相关的miRNA标志物及其应用

本发明属于生物检测，具体涉及一种与虹鳟热应激相关的mirna标志物及其应用。

背景技术：

1、热应激，表示生物体在高温下的非特异性生理反应，应激导致系统的生理和生物化学变化，它导致代谢失衡，破坏组织和器官。最近热应激在动物福利和健康方面的作用受到了相当大的关注。热应激会诱发复杂的反应，细胞中的热应激适应是一个复杂的多基因调控步骤。热应激改变了热休克蛋白的水平，这是参与生物体内细胞活动的关键分子伴侣。mirnas是内源性的、非编码的rna(长度为21-23个核苷酸)，显示出高度保守的进化。它们通过作用于目标基因的orf区域、3'-utr和5'-utr来促进目标基因的降解或抑制其翻译，从而调节基因水平。mirnas调节与不同细胞过程有关的不同基因水平，并在转录后水平上进行控制。mirna与复杂的生理事件如细胞发育、生长、分化、凋亡和免疫反应有关。此外，高度保守的哺乳动物mirnas针对数百个mrnas调节不同的重要生物事件。

2、虹鳟是一种经济型的冷水鱼。它的适宜生长温度为12℃～18°c，因此对高温敏感。暴露在25℃水温下的虹鳟肝细胞出现了坏死和凋亡的病理改变。现有的mir-8159-x过表达组荧光素酶活性下调且差异不显著，且对虹鳟肝细胞凋亡不具有促进作用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种mir-8159-x过表达组荧光素酶活性下调且差异显著，且对虹鳟肝细胞凋亡具有促进作用的虹鳟热应激相关的mirna标志物及其应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种与虹鳟热应激相关的mirna标志物，包括细胞转染、双荧光素酶报告基因检测、细胞增殖、细胞凋亡、转染mir-8159-x热应激下hsp90a1 mrna检测、转染mirna后热应激处理、rt-qpcr检测hsp90a1 mrna表达、转染mir-8159-x后western blot检测hsp90a1蛋白表达，所述rt-qpcr检测hsp90a1 mrna表达步骤为：向虹鳟肝细胞中转染mir-8159-x模拟物、mir-8159-x抑制物以及阴性对照，待48h稳定后，热处理4、8、12、24、48h后收集细胞提取rna，检测hsp90a1 mrna相对表达量。

4、作为优选，所述细胞转染包括如下步骤：

5、1)转染前先接种细胞到96孔板，接种方法同上细胞传代方法；

6、2)待细胞接种后生长密度达到80％-90％时，进行转染；

7、3)转染前将上述各组重组质粒与转染试剂按照1:1比例混合制备复合物，用移液器吹吸10～15次混匀，室温静置10～15min；

8、4)将上述复合物加入到有完全培养基的hek 293t细胞中，置于37℃，5％co2培养箱培养；

9、5)对细胞进行24h换液及后续实验处理。

10、作为优选，所述双荧光素酶报告基因检测包括如下步骤：

11、1)将转染的96孔板从培养箱中取出，放置10min使培养板平衡至室温；

12、2)向96孔培养箱各孔加入与培养基等体积的萤火虫荧光素酶检测试剂，混合均匀；

13、3)避光静置15min，待细胞充分裂解后，在酶标仪上检测萤火虫荧光素酶发光信号；

14、4)从酶标仪取出，向各孔加入与初始培养基体积相同的海肾荧光素酶检测试剂，在水平摇床上混合均匀；

15、5)避光静置15min后，在酶标仪上检测海肾荧光素酶发光信号；

16、6)计算各孔萤火虫荧光素酶信号/海肾荧光素酶酶信号的比值，比值的大小反应了双荧光素酶活性的大小。

17、作为优选，所述细胞凋亡包括如下步骤：

18、1)将细胞收集于1.5ml离心管内，离心弃上清；

19、2)细胞沉淀用0.8ml细胞染色缓冲液重悬细胞；

20、3)加入5ul hoechst染色液；

21、4)加入5ul pi染色液；

22、5)混匀，冰浴或4℃孵育20-30min；

23、6)用流式细胞仪检测红色荧光和蓝色荧光。

24、作为优选，所述转染mir-8159-x热应激下hsp90a1 mrna检测步骤为：将mir-8159-x模拟物、mir-8159-x抑制物以及阴性对照分别转染至虹鳟原代肝细胞中，待48h转染稳定后，将其转移至24℃中热处理4、8、12、24、48h，然后通过rt-qpcr和western blot方法检测每个时间点hsp90a1 mrna表达量和蛋白表达量，以此来验证热应激下mir-8159-x对靶基因hsp90a1 mrna和蛋白的表达的影响。

25、作为优选，所述转染mirna后热应激处理包括如下步骤：

26、1)将消化好的细胞均匀地铺在12孔板中，待细胞长满至60％-70％开始转染；

27、2)将mir-8159-x模拟物、mir-8159-x抑制物、mir-8159-x阴性对照分别转染进虹鳟原代肝细胞中放入18℃、5％co2培养箱中待48h稳定后进行下一步操作；

28、3)更换新的培养基后将细胞转移至24℃、5％co2培养箱中开始热应激处理；

29、4)分别在热处理4、8、12、24、48h收集细胞；

30、5)将收集好的细胞提取rna和蛋白。

31、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

32、1)本发明中的mir-8159-x过表达组荧光素酶活性下调且差异显著，mir-8159-x与hsp90a1存在靶向关系。

33、2)本发明中mir-8159-x过表达组靶基因hsp90a1的表达水平均显著降低48.05％(p<0.05)；mir-8159-x被抑制后，靶基因hsp90a1的表达水平升高1.17倍(p>0.05)，说明mir-8159-x对hsp90a1具有负调控作用。

34、3)本发明中mir-8159-x对虹鳟肝细胞凋亡具有促进作用，mir-8159-x对hsp90a1蛋白的表达也具有负调控作用，但滞后于mrna表达。

技术特征：

1.一种与虹鳟热应激相关的mirna标志物，包括细胞转染、双荧光素酶报告基因检测、细胞增殖、细胞凋亡、转染mir-8159-x热应激下hsp90a1mrna检测、转染mirna后热应激处理、rt-qpcr检测hsp90a1mrna表达、转染mir-8159-x后westernblot检测hsp90a1蛋白表达，其特征在于所述rt-qpcr检测hsp90a1mrna表达步骤为：向虹鳟肝细胞中转染mir-8159-x模拟物、mir-8159-x抑制物以及阴性对照，待48h稳定后，热处理4、8、12、24、48h后收集细胞提取rna，检测hsp90a1mrna相对表达量。

2.根据权利要求1所述的一种与虹鳟热应激相关的mirna标志物，其特征在于所述细胞转染包括如下步骤：

3.根据权利要求1所述的一种与虹鳟热应激相关的mirna标志物，其特征在于所述双荧光素酶报告基因检测包括如下步骤：

4.根据权利要求1所述的一种与虹鳟热应激相关的mirna标志物，其特征在于所述细胞凋亡包括如下步骤：

5.根据权利要求1所述的一种与虹鳟热应激相关的mirna标志物，其特征在于所述转染mir-8159-x热应激下hsp90a1mrna检测步骤为：将mir-8159-x模拟物、mir-8159-x抑制物以及阴性对照分别转染至虹鳟原代肝细胞中，待48h转染稳定后，将其转移至24℃中热处理4、8、12、24、48h，然后通过rt-qpcr和westernblot方法检测每个时间点hsp90a1mrna表达量和蛋白表达量，以此来验证热应激下mir-8159-x对靶基因hsp90a1mrna和蛋白的表达的影响。

6.根据权利要求1所述的一种与虹鳟热应激相关的mirna标志物，其特征在于所述转染mirna后热应激处理包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种与虹鳟热应激相关的miRNA标志物及其应用，属于生物检测技术领域。本发明通过细胞转染、双荧光素酶报告基因检测、细胞增殖、细胞凋亡、转染miR‑8159‑x热应激下hsp90a1mRNA检测、转染miRNA后热应激处理、RT‑qPCR检测hsp90a1mRNA表达、转染miR‑8159‑x后WesternBlot检测Hsp90a1蛋白表达这八个步骤予以实现。本发明中的miR‑8159‑x过表达组荧光素酶活性下调且差异显著，miR‑8159‑x与hsp90a1存在靶向关系。本发明中miR‑8159‑x过表达组靶基因hsp90a1的表达水平均显著降低48.05％；miR‑8159‑x被抑制后，靶基因hsp90a1的表达水平升高1.17倍，说明miR‑8159‑x对hsp90a1具有负调控作用。本发明中miR‑8159‑x对虹鳟肝细胞凋亡具有促进作用，miR‑8159‑x对Hsp90a1蛋白的表达也具有负调控作用，但滞后于mRNA表达。

技术研发人员：权金强,刘哲,赵桂研
受保护的技术使用者：甘肃农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13