末端转移酶突变体及其应用的制作方法

本发明属于生物或测序领域，具体涉及末端转移酶突变体及其应用。

背景技术：

1、末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase,tdt,简称末端转移酶)是一种聚合酶，属于聚合酶家族x。其主要来源于脊椎动物的免疫系统，是适应性免疫系统中不可缺少的重要蛋白之一。与绝大多数模板依赖型聚合酶不同，tdt是一种特殊的聚合酶，其天然活性为催化非模板依赖的聚合反应，可以在单链dna的游离3’端随机添加dntp，这一特性与固相法寡核苷酸合成技术中对催化剂的要求极其相符。但是在固相法寡核苷酸合成中，每个循环只能延伸一个核苷酸，并且需要采用一定的技术手段阻断聚合反应的进行。一般情况下，采用阻断基团修饰的核苷酸底物就可以实现聚合反应的阻断，即在tdt催化聚合了一个阻断底物后，延伸反应就不再继续进行。而通过一定方法去除该阻断基团后，就可以进入下一轮的循环。这种由tdt催化的以阻断核苷酸为底物的寡核苷酸合成策略，只需要两步即可完成一个循环，极大地提高了单循环效率q的可能极限值。

2、末端转移酶在生物技术领域有诸多应用和极大潜力，除了当前已经比较成熟的核酸标记(如tunel，末端转移酶介导的dutp缺口端修饰)外，其还可以应用在测序建库、dna合成、基于dna的信息存储、dna纳米材料制造、dna检测、mirna检测和生化检测等方面。

3、现有的末端转移酶商品均为野生型蛋白，如terminal transferase(neb)、terminal deoxynucleotidyl transferase(thermo scientific)。而此类末端转移酶的催化效率较低，反应速度较慢。因此，市场上需要性能更佳的末端转移酶。

技术实现思路

1、为解决现有技术中缺乏性能更佳的末端转移酶的问题，本发明提供了一种高效的末端转移酶突变体，相对于野生型末端转移酶，其具有更高的催化效率，尤其对于修饰底物，效率显著提高。

2、具体而言，本发明第一方面提供了一种末端转移酶突变体，与seq id no：2所示的野生型末端转移酶氨基酸序列相比，所述突变体在如下一个或多个位点的氨基酸残基发生突变：338、339、340，且所述突变体具有末端转移活性。

3、上文中位点338、339、340为seq id no：2上的第338、339、340位。上述突变均为点突变，不会导致插入、缺失或者移码。

4、在一个具体实施方案中，所述各个位点的突变方式如下：

5、第338位的k突变为q、r或n；

6、第339位的m突变为g；

7、第340位的t突变为q、r、n或k。

8、在一个具体实施方案中，与野生型末端转移酶相比，所述突变体的末端转移活性提高。

9、优选地，所述突变体的末端转移活性提高至所述野生型末端转移酶的2-3倍。

10、在一个具体实施方案中，所述突变体具有如下任意一种突变：

11、(1)m339g和t340q；

12、(2)m339g和t340r；

13、(3)m339g和t340n；

14、或(4)m339g和t340k。

15、本发明第二方面提供了编码本发明第一方面所述的任一末端转移酶突变体的核酸分子。

16、在一个具体实施方案中，所述核酸分子的dna序列如seq id no：1所示。

17、本发明第三方面提供了含有本发明第二方面的核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞系。

18、本发明第四方面提供了一种重组菌，其含有本发明第二方面所述的核酸分子。

19、本发明第五方面提供了本发明第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达盒、重组载体或转基因细胞系或本发明第四方面所述的重组菌在制备末端转移酶中的应用。

20、本发明第六方面提供了一种制备本发明第一方面所述的任一末端转移酶突变体的方法，包括如下步骤：培养本发明第四方面所述的重组菌，再进行诱导处理，得到本发明第一方面所述的任一末端转移酶突变体。

21、本发明第七方面提供了一种试剂盒，包括本发明第一方面所述的任一末端转移酶突变体。

22、本发明第八方面提供了一种末端转移核酸分子的方法，包括如下步骤：

23、将核酸分子、末端转移酶和dntp混合，其中，所述核酸分子具有单链形式的游离3’末端，且所述末端转移酶为本发明第一方面所述的任一突变体；

24、在所述核酸分子的3’末端随机添加一个或多个dntp。

25、本发明第九方面提供了本发明第一方面所述的任一末端转移酶突变体、或本发明第七方面所述的试剂盒在构建测序文库中的应用。

26、与野生型末端转移酶相比，本发明的末端转移酶突变体具有更高的催化效率，尤其对于修饰底物，效率显著提高，非常适合在末端转移反应中使用。

技术特征：

1.一种末端转移酶突变体，与seq id no：2所示的野生型末端转移酶氨基酸序列相比，所述突变体在如下一个或多个位点的氨基酸残基发生突变：338、339、340，且所述突变体具有末端转移活性。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述各个位点的突变方式如下：

3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，与野生型末端转移酶相比，所述突变体的末端转移活性提高。

4.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体的末端转移活性提高至所述野生型末端转移酶的2-3倍。

5.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体具有如下任意一种突变：

6.编码权利要求1-5中任一所述突变体的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的dna序列如seq idno：1所示。

8.含有权利要求6或7所述核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞系。

9.一种重组菌，其含有权利要求6或7所述核酸分子。

10.权利要求6或7所述核酸分子、权利要8所述表达盒、重组载体或转基因细胞系或权利要求9所述重组菌在制备末端转移酶中的应用。

11.一种制备权利要求1-5中任一所述末端转移酶突变体的方法，包括如下步骤：培养权利要求9所述重组菌，再进行诱导处理，得到权利要求1-5中任一所述突变体。

12.一种试剂盒，包括权利要求1-5中任一所述末端转移酶突变体。

13.一种末端转移核酸分子的方法，包括如下步骤：

14.权利要求1-5任一所述的末端转移酶突变体、或权利要求12所述的试剂盒在构建测序文库中的应用。

技术总结
本发明提供了末端转移酶突变体，与SEQ ID NO：2所示的野生型末端转移酶氨基酸序列相比，该突变体在如下一个或多个位点的氨基酸残基发生突变：338、339、340，且该突变体具有末端转移活性。该突变体的末端转移催化活性显著提升。

技术研发人员：郭斐,王子,郑越,谢庆庆,董宇亮,章文蔚
受保护的技术使用者：深圳华大生命科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/8/20