一种制备平菇球形病毒的抗血清的方法及应用

本发明属于植物病毒学，具体涉及一种制备平菇球形病毒的抗血清的方法及应用。

背景技术：

1、近年来平菇病毒病害成为当地平菇生产上重要病害，不论是冬暖大棚、层架式栽培还是半地下墙式栽培模式，平菇球形菇均普遍发生，且不易防治，平菇球形病是平菇栽培过程中，影响平菇效益的主要原因之一，目前没有有效的防治办法，预防平菇病毒病害的发生也是非常困难。近年来，国内外对平菇病毒病的发生和诊断相继有报道。平菇被病毒侵染后，可能会出现菌丝退化，子实体畸形，菌柄短粗等症状，给菇农造成严重的经济损失。而平菇球形菇病症早期不易发现，出菇才显症，不易防控。经检测发现，平菇上携带的病毒大部分是rna病毒，发生最广泛、危害最严重的就是平菇球形病毒(oyster mushroom sphericalvirus，omsv)，具有潜隐性特点。

2、目前平菇病毒的主要检测方法有电镜法、分子生物学及血清学等检测技术。电镜法可以观察到病毒形状和大小，但电镜检测需要用到的设备比较昂贵操作比较复杂，并且需要样品中含有的病毒浓度较高，因此其应用受到一定的限制。应用比较多的是根据病毒的核酸及外壳蛋白为基础的血清学及分子生物学检测技术。自上世纪六七十年代以来，血清学技术逐步发展起来，很多血清学方法应用到食用菌病毒的检测中来，该检测方法不仅能够确定样本是否被病毒感染，而且还能反应病毒含量高低。开发利用平菇球形病毒的外壳蛋白制备抗血清的方法可以有效的用于对该病毒的检测，目前还没有相关的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种平菇球形病毒的抗血清，通过免疫大白兔对平菇球形病毒外壳蛋白刺激所产生免疫反应获得免疫抗体——多抗血清，该血清不仅可以灵敏地检测平菇是否感染病毒还可以检测样品的带毒量。

2、本发明的目的之二在于提供上述平菇球形病毒的抗血清的应用。通过实验验证，其不仅可以用于检测平菇上的平菇球形病毒，还发现了其新寄主-秀珍菇，因此还可以用来检测秀珍菇上是否存在平菇球形病毒。

3、为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：

4、一种制备平菇球形病毒的抗血清的方法，以平菇球形病毒的外壳蛋白作为免疫原免疫动物；所述平菇球形病毒的外壳蛋白为氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、优选地，所述动物为新西兰大白兔。

6、所述平菇球形病毒的外壳蛋白抗血清的具体获取方法为：

7、(1)构建表达载体：首先提取菇球形病毒的总rna，以平菇球形病毒的外壳蛋白的编码基因为模板，构建表达载体pdb-mbp-cp；

8、(2)诱导表达：将构建的表达载体pdb-mbp-cp转化rosetta(de-3)菌株；收集菌体；

9、(3)蛋白纯化：将收集的菌体进行纯化，浓缩；

10、通过收集纯化过程中各个阶段不同咪唑浓度下的蛋白洗脱液10ml，分别取10μl蛋白样品加等体积2×sds上样缓冲液制蛋白样，用12.5％sds-page胶进行电泳检测。结果显示，在收集的20mm、100mm、250mm咪唑洗脱液中存在目的融合蛋白，其中100mm咪唑洗脱液中目的蛋白纯度较高；

11、选用30kda的浓缩管对100mm咪唑洗脱液进行浓缩，并且用不含咪唑的缓冲液多次进行置换，去除其中的咪唑。将获得的2ml 4.0mg/ml的蛋白样品送至华大蛋白公司免疫新西兰大白兔以制备多抗血清，并对制备好的血清进行了验证，对于原核表达的融合蛋白具有较高的灵敏度；

12、(4)抗血清的制备：将浓缩后的蛋白免疫新西兰大白兔以制备多抗血清。

13、优选地，所述诱导表达的条件为：0.1mm iptg，在18℃ 200rpm诱导20h，诱导2l菌体表达。

14、另外，蛋白纯化的过程中，于冰水浴中采用超声破碎细胞，超声破碎条件：20mmtris-hcl，500mm nacl，1mm edta，1mm pmsf；融合蛋白c端带his标签，菌体破碎后进行亲和层析，纯化过程利用镍柱进行亲和纯化。

15、利用该血清对感染omsv的平菇菌株进行检测发现带毒菌株能够特异性的杂到约30kda的蛋白，并且条带单一明亮清晰，说明该血清能够很好的用于omsv的病毒粒体的检测。

16、本发明还保护上述抗血清在检测平菇以及秀珍菇中的是否存在平菇球形病毒中的应用。

17、另外，本发明还公开了一种筛选平菇/秀珍菇无毒菌种的方法，利用上述方法制备的平菇球形病毒的抗血清对平菇/秀珍菇进行检测，筛选出无平菇球形病毒的平菇/秀珍菇菌种，以降低由于平菇球形病毒感染对蘑菇生产造成的损失，有助于提高蘑菇的产量。

18、本发明的优点：

19、本发明首次公开了一种平菇球形病毒的抗血清，该血清不仅可以灵敏地检测平菇是否感染病毒还可以检测样品的带毒量，为该病毒的血清学检测以及平菇生产中该病害的防控提供理论基础。

20、另外，目前还没有关于秀珍菇感染平菇球形病毒的报道，本发明首次公开了其在检测秀珍菇中的平菇球形病毒中的应用，也就是说本发明公开了一种平菇球形病毒的新寄主，为秀珍菇的病害防控也提供了一种新的思路。

技术特征：

1.一种制备平菇球形病毒的抗血清的方法，包括如下步骤：以平菇球形病毒的外壳蛋白作为免疫原免疫动物；所述平菇球形病毒的外壳蛋白为氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述动物为新西兰大白兔。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述平菇球形病毒的外壳蛋白抗血清的具体获取方法为：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：诱导表达的条件为：0.1mm iptg，在18℃，200rpm诱导20h，诱导2l菌体表达。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：蛋白纯化的过程中，于冰水浴中采用超声破碎细胞，超声破碎条件：20mm tris-hcl，500mm nacl，1mm edta，1mm pmsf；融合蛋白n端带his.mbp标签，菌体破碎后进行亲和层析，纯化过程利用镍柱进行亲和纯化。

6.利用权利要求1-5中任一项所述的方法制备得到的平菇球形病毒的抗血清。

7.权利要求6所述的抗血清在检测平菇中的是否存在平菇球形病毒中的应用。

8.权利要求6所述的抗血清在检测秀珍菇中是否存在平菇球形病毒中的应用。

9.一种筛选平菇/秀珍菇无毒菌种的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的方法制备的平菇球形病毒的抗血清对平菇/秀珍菇进行检测，筛选出无平菇球形病毒的平菇/秀珍菇菌种。

技术总结
本发明公开了一种制备平菇球形病毒的抗血清的方法及应用，所述方法包括以平菇球形病毒的外壳蛋白作为免疫原免疫动物；所述平菇球形病毒的外壳蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次公开了一种平菇球形病毒的抗血清，该血清不仅可以灵敏地检测平菇是否感染病毒还可以检测样品的带毒量，为该病毒的血清学检测以及平菇生产中该病害的防控提供理论基础。另外，目前还没有关于秀珍菇感染平菇球形病毒的报道，本发明首次公开了其在检测秀珍菇中的平菇球形病毒中的应用，也就是说本发明公开了一种平菇球形病毒的新寄主，为秀珍菇的病害防控也提供了一种新的思路。

技术研发人员：张晓艳,王一帆,扈海静,闫俊杰,张文静
受保护的技术使用者：鲁东大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13