乙酰辅酶A合成酶ACS突变体及其在2-吡咯烷酮生产中的应用的制作方法

本发明涉及乙酰辅酶a合成酶acs突变体及其在2-吡咯烷酮生产中的应用，属于基因工程。

背景技术：

1、2-吡咯烷酮(2-pyrrolidone,2p)，又称2-氧代吡咯烷、γ-丁内酰胺，是一类具有一个五元内酰胺环的吡咯烷类化合物，广泛存在于天然产物和各类人工合成的化合物当中。2-吡咯烷酮是生产聚乙烯吡咯烷酮、锦纶-4和脑复康(酰胺吡咯烷酮)的原料，在医药领域和工业领域具有广泛且重要的用途。

2、2-吡咯烷酮可由化学法或生物法合成。其中化学法合成通常由γ-丁内酯经氨化而得。以丁二醇为原料，在200℃下，在铜催化剂存在下，生成γ-丁内酯，再与氨(或胺)反应，可制得2-吡咯烷酮。另一种化学合成方法为以4-羟基丁酰胺为原料，在高压和高温下脱水进行制备。

3、近年来已经有一些国内外的文献报道了关于使用微生物生产2-吡咯烷酮。目前产量最高的是，tong un chae通过对大肠杆菌的改造，产量可达54g/l。通过过表达乙酰辅酶a转移酶基因act，可将γ-氨基丁酸转化为γ-氨基丁酸辅酶a(γ-gaba-coa)，γ-氨基丁酸辅酶a可自反环化生成2-吡咯烷酮。

4、目前生物法的不足：产量比较低、发酵工艺复杂、成本高等缺陷，难以商业应用。在合成2-吡咯烷酮时，乙酰辅酶a转移酶是其关键性酶。使用乙酰辅酶a转移酶将γ-氨基丁酸转化为γ-氨基丁酸辅酶a时，需要乙酰辅酶a作为辅酶a供体，因此若乙酰辅酶a不足会严重影响2-吡咯烷酮的合成。同时在2-吡咯烷酮合成过程中，乙酰辅酶a在乙酰辅酶a转移酶催化下将产生大量的乙酸，乙酸积累可显著影响细菌生长并降低目标产物产量。

技术实现思路

1、本发明提供一株产2-吡咯烷酮的谷氨酸棒杆菌底盘菌株，在谷氨酸棒杆菌ff10的基础上，表达了来源于butyricicoccus faecihominis菌株的辅酶a转移酶，并进行了如下改进：

2、(1)敲除丙酮酸脱氢酶poxb，并增加乌头酸水合酶的表达；

3、(2)敲除磷酸乙酰转移酶，并增强6-磷酸果糖激酶的表达；

4、(3)敲除转录调节因子iolr和/或sugr，并过表达谷氨酸脱羧酶。

5、在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌ff10公开于公开号为cn114752544b的专利中。

6、在一种实施方式中，以pces为载体，表达所述辅酶a转移酶；所述辅酶a转移酶具有genbank登录号mcq5130945.1所示的氨基酸序列。

7、在一种实施方式中，所述丙酮酸脱氢酶poxb具有genbank登录号caf21272.1所示的氨基酸序列；所述乌头酸水合酶具有genbank登录号bab98933.1所示的氨基酸序列。

8、在一种实施方式中，所述磷酸乙酰转移酶具有genbank登录号：caf20775.1所示的氨基酸序列；所述6-磷酸果糖激酶具有genbank登录号：bab98643.1所示的氨基酸序列。

9、在一种实施方式中，所述转录调节因子iolr具有genbank登录号asw12947.1所示的氨基酸序列；所述转录调节因子sugr具有genbank登录号asw14321.1所示的氨基酸序列。

10、在一种实施方式中，所述谷氨酸脱羧酶为谷氨酸脱羧酶gad mut128，是具有d38n/i89v/d92n//e93q/s153t/d202n/p268t/e294r/d301n/f355y/d432n/h435q/l451*突变的谷氨酸脱羧酶，氨基酸序列如seq id no.9所示，已公开于公开号为cn114752589b的专利中。

11、在一种实施方式中，所述底盘菌株还敲除了乙酸辅酶a转移酶acta，并表达了乙酰辅酶a合成酶。

12、在一种实施方式中，所述乙酸辅酶a转移酶acta的genbank登录号为caf21230.1。

13、在一种实施方式中，所述乙酰辅酶a合成酶来源于大肠杆菌mg1655。

14、在一种实施方式中，所述乙酰辅酶a合成酶acs的genbank登录号为np_418493.1。

15、在一种实施方式中，用seq id no.10所示的启动子ptuf强化乙酰辅酶a合成酶的表达。

16、在一种实施方式中，所述乙酰辅酶a合成酶是以seq id no.2所示序列为出发序列，进行了如下至少一处突变：

17、(1)将第72位天冬氨酸变为酪氨酸；

18、(2)将第155位异亮氨酸变为苏氨酸；

19、(3)将第167位丝氨酸变为苏氨酸。

20、本发明还要求保护乙酰辅酶a合成酶突变体，所述突变体含有seq id no.4、seqidno.6、seq id no.8所示的氨基酸序列。

21、本发明还要求保护所述底盘菌株在发酵生产2-吡咯烷酮中的应用。

22、在一种实施方式中，所述应用是将所述谷氨酸棒杆菌在cgxii培养基中发酵。

23、有益效果：本发明通过在底盘菌中过表达大肠杆菌来源的乙酰辅酶a合成酶，实现高效的乙酰辅酶a循环，减少了发酵过程中乙酸积累。进一步对乙酰辅酶a合成酶进行酶工程改造，通过突变提高了乙酰辅酶a合成酶的催化活性，进而进一步提高了2-吡咯烷酮的产量。

技术特征：

1.一株产2-吡咯烷酮的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在谷氨酸棒杆菌ff10的基础上，表达了来源于butyricicoccus faecihominis的辅酶a转移酶，并进行了(1)～(3)所示改进：

2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以pces为载体，表达所述辅酶a转移酶；所述辅酶a转移酶具有genbank登录号mcq5130945.1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列如seq id no.9所示。

4.根据权利要求1～3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，还敲除了乙酸辅酶a转移酶，并表达了乙酰辅酶a合成酶。

5.根据权利要求4所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，用seq id no.10所示的启动子ptuf强化乙酰辅酶a合成酶的表达。

6.根据权利要求5所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述乙酰辅酶a合成酶具有genbank登录号np_418493.1所示的序列。

7.根据权利要求5所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述乙酰辅酶a合成酶是以seq id no.2所示序列为出发序列，进行了如下至少一处突变：

8.乙酰辅酶a合成酶突变体，其特征在于，含有seq id no.4、seq id no.6、seq idno.8所示的氨基酸序列。

9.一种发酵生产2-吡咯烷酮的方法，其特征在于，以权利要求1～7任一所述的重组谷氨酸棒杆菌为发酵菌株，在cgxii培养基中发酵。

10.权利要求1～7任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，或权利要求9所述的方法在生产含2-吡咯烷酮的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了乙酰辅酶A合成酶ACS突变体及其在2‑吡咯烷酮生产中的应用，属于基因工程技术领域。本发明通过在底盘菌中过表达大肠杆菌来源的乙酰辅酶A合成酶，实现高效的乙酰辅酶A循环，减少了发酵过程中乙酸积累。进一步对乙酰辅酶A合成酶进行酶工程改造，通过突变提高了乙酰辅酶A合成酶的催化活性，进而进一步提高了2‑吡咯烷酮的产量，使构建的重组菌发酵96h的2‑吡咯烷酮产量达14.47～18.34g/L。

技术研发人员：陈升宝,宋亚楠,彭莺祺,曹利红
受保护的技术使用者：潍坊亚森生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14