一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽、制备方法及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽、制备方法及其应用。

背景技术：

1、猕猴桃由于其较高的营养价值，是世界范围内商业生产发展后重要的经济果树作物，中国是最大的猕猴桃生产国，其次是新西兰和意大利。目前由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(pseudomonas syringae pv.actinidiae，psa)引起的猕猴桃溃疡病，已造成严重损失，并严重威胁猕猴桃生产。猕猴桃溃疡病表现为独特的田间症状，如叶斑、花坏死、树枝枯梢、典型的躯干溃疡和红色或白色渗出物。psa作为一种需氧革兰氏阴性植物病原体，该细菌具有高毒力和快速传播性能，由其引起的猕猴桃溃疡病难以控制，被欧洲植物保护组织认为是一种检疫性病原体。

2、目前已经开发了各种方法来限制psa的传播，包括定期监测、去除受感染的植物体、喷洒抗生素以及使用生物防治剂和宿主抗性诱导子。尽管化学控制已被广泛用于控制猕猴桃溃疡病，但过度依赖化学品(如链霉素和铜制剂)会导致环境污染、抗生素残留和病原体抗性等问题。虽然现有生物防治剂中有用抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)用于抑菌研究的，但是抗菌肽抑菌活性低且分子量大，而在psa防治中未见相关报道，amps对psa的作用机制尚不清楚，amps是否在植株体内仍具有抗psa活性尚不明确。

技术实现思路

1、针对上述存在问题，本发明提供了一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽、制备方法及其应用，所述抗菌肽在体内体外对猕猴桃溃疡病菌均具有较高的抗菌活性，作用机制独特、溶血活性低、不诱发耐药性。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列为trp-trp-lys-leu-leu-arg-lys-leu-nh2，其序列特征为含有8个氨基酸残基且羧基端酰胺化修饰。

4、优选的，所述抗菌肽的分子量为1140.4da，等电点为12.4，带有+4电荷，疏水性为33.60，具有典型的两亲性结构。

5、本发明提供所述抗菌肽的制备方法是利用fmoc多肽固相合成的方法从c端到n端人工合成抗菌肽，包括如下步骤：将rink树脂进行fmoc脱除处理，然后与氨基酸混合偶联，重复氨基酸偶联步骤的操作，按照所述抗菌肽序列依次加入相应的氨基酸，直至多肽合成完毕。

6、优选的，所述氨基酸的加入量是rink树脂用量的4倍。

7、本发明提供所述抗菌肽在制备防治猕猴桃溃疡病菌药物中的应用。

8、优选的，所述抗菌肽对猕猴桃溃疡病菌的最小抑菌浓度为3.13μg/ml，半最大有效浓度为1.67μg/ml。

9、优选的，所述药物包括除所述抗菌肽以外的不影响抗菌肽活性的其他组分。

10、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

11、本发明首次利用fmoc多肽固相合成的方法从c端到n端人工合成所述抗菌肽trp-trp-lys-leu-leu-arg-lys-leu-nh2，并指出该抗菌肽的分子量为1140.4da，等电点为12.4，带有+4电荷，疏水性为33.60，具有典型的两亲性结构，碱性氨基酸聚集在同一边。相对于现有抑菌活性的抗菌肽分子量小，易于人工合成，降低了人工合成成本。

12、本发明首次发现所述抗菌肽具有抑制psa的作用，其中色氨酸(trp，w)的融合芳香环更倾向于微生物的膜界面，精氨酸(arg，r)的加入可以提高抗菌活性，增强抗菌肽包埋到psa细胞膜中。该抗菌肽在体内、体外均可有效抑制psa，可作为杀菌剂应用于猕猴桃溃疡病菌的防治。

技术特征：

1.一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为trp-trp-lys-leu-leu-arg-lys-leu-nh2，其序列特征为含有8个氨基酸残基且羧基端酰胺化修饰。

2.如权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的分子量为1140.4da，等电点为12.4，带有+4电荷，疏水性为33.60，具有典型的两亲性结构。

3.如权利要求1或2所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法是利用fmoc多肽固相合成的方法从c端到n端人工合成抗菌肽，包括如下步骤：将rink树脂进行fmoc脱除处理，然后与氨基酸混合偶联，重复氨基酸偶联步骤的操作，按照所述抗菌肽序列依次加入相应的氨基酸，直至多肽合成完毕。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸的加入量是rink树脂用量的4倍。

5.如权利要求1或2所述的抗菌肽在制备防治猕猴桃溃疡病菌药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽对猕猴桃溃疡病菌的最小抑菌浓度为3.13μg/ml，半最大有效浓度为1.67μg/ml。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包括除所述抗菌肽以外的不影响抗菌肽活性的其他组分。

技术总结
本发明提供一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽、制备方法及其应用，属于生物技术领域。本发明所述抗菌肽的氨基酸序列为Trp‑Trp‑Lys‑Leu‑Leu‑Arg‑Lys‑Leu‑NH<subgt;2</subgt;，具有典型的两亲性结构。该抗菌肽可靶向猕猴桃溃疡病菌细胞膜，增加其膜的通透性和耗散膜电位，导致钙离子渗漏。该抗菌肽还作用于细胞内靶标，影响DNA功能，降低酯酶的活性和诱导活性氧的生成。该抗菌肽对猕猴桃溃疡病菌的最小抑菌浓度为3.13μg/mL，半最大有效浓度为1.67μg/mL，其活性明显高于农用链霉素。本发明制备的抗菌肽在体内、体外均可有效控制猕猴桃溃疡病菌，可作为杀菌剂应用于猕猴桃溃疡病的防治。

技术研发人员：党向利,王丽芳,张铭宇
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11