一种不受Hrd1泛素化降解的突变CDVH蛋白、突变CDV病毒及应用

本发明涉及一种不受hrd1泛素化降解的突变cdvh蛋白、突变cdv病毒及应用，属于生物。

背景技术：

1、犬瘟热(canine distemper,cd)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,cdv)引起的一种高度接触性传染病，具有上皮细胞、淋巴细胞和神经细胞的趋向性，可导致全身感染，主要引起呼吸道，消化道，泌尿系统，淋巴系统，皮肤，骨骼和中枢神经系统疾病。cdv给毛皮动物和犬产业造成了严重的经济损失，对野生动物保护构成了重要威胁。但近年来全球cd的发病率有所上升。有报道cdv跨物种感染非人类灵长类动物，这也引起了人们对人类cdv潜在的人畜共患风险的一些担忧。因此，cdv仍然是一种重要的全球流行性传染病。

2、cdv的基因组是一个包含15690个核苷酸的单链负rna，包括6个编码核衣壳蛋白(n)、磷蛋白(p)、large(l)、基质(m)、血凝素(h)、融合蛋白(f)和非编码区(utrs)的区域。其中h蛋白作为一种包膜蛋白与特定的宿主细胞受体(slam、nectin-4或其他)相互作用，从而决定病毒嗜性。h蛋白也能构诱导机体产生中和抗体，在犬瘟热病毒的免疫保护中发挥重要的作用。接种疫苗是防控cdv感染的主要策略，但cdv在细胞中的培养滴度不高，制约了cdv疫苗的研制与发展，目前仍然存在免疫失败的现象。如何维持和增加免疫保护性抗原h蛋白含量，提高病毒复制能力，从而刺激产生更多抗体是目前cdv疫苗创制中亟待解决的问题之一。

3、宿主蛋白hrd1具有e3泛素连接酶活性，对包括病毒蛋白在内的多种底物蛋白进行泛素化修饰，并介导其通过蛋白酶体途径降解。对于cdv而言，目前还未见报道。我们通过质谱发现hrd1与cdv h蛋白互作，生物信息学预测cdv h蛋白含有7个赖氨酸可作为潜在的泛素化修饰位点。目前hrd1对于cdvh蛋白稳定性的影响并未得到研究。

技术实现思路

1、技术问题

2、为了避免cdv主要保护性抗原h蛋白在细胞中的降解，维持其蛋白稳定性的问题，本发明的目的在于提供一种不受e3泛素连接酶hrd1泛素蛋白酶体降解的突变cdv h蛋白、突变病毒及应用。该突变cdv h蛋白在细胞中不被hrd1介导的泛素化蛋白酶体途径降解，该突变病毒在细胞中病毒滴度高，可替代原有cdv疫苗株，提高免疫保护效果和有利于抗病毒药物的开发。

3、技术方案

4、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

5、一种不受hrd1泛素化降解的突变cdv h蛋白，其特征在于：该突变cdv h蛋白在细胞的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解中保持完整性。

6、所述的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解是由宿主hrd1蛋白介导。所述cdv h蛋白的突变氨基酸位点位于cdv h蛋白上自氨基端起第115位氨基酸。

7、所述突变的cdv h蛋白是h蛋白发生k115r突变的cdv h蛋白。

8、含有所述突变cdv h蛋白的突变cdv病毒，其特征在于：该突变的cdv病毒的h蛋白在细胞的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解中保持完整性。

9、所述的突变cdv病毒，其特征在于：所述泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解是由宿主hrd1蛋白介导。

10、所述的突变cdv病毒，其特征在于：所述cdv病毒的突变氨基酸位点位于cdv h蛋白上自氨基端起第115位氨基酸。

11、所述的突变cdv病毒，其特征在于：所述突变的cdv病毒是h蛋白发生k115r的突变cdv病毒。

12、所述的突变cdv病毒的制备方法，其特征在于：通过点突变pcr对cdv病毒的h蛋白进行k115r突变，重叠pcr将k115r突变的h蛋白基因引入cdv基因组序列，同时在该基因组序列两端引入锤头核酶及丁肝核酶序列，然后连接到pci质粒，与cdv n、p、l蛋白质粒为辅助质粒共转染细胞，即为制备的不受hrd1泛素化降解的突变cdv病毒。

13、所述的突变cdv h蛋白可以在制备cdv疫苗中应用。

14、所述的突变cdv病毒可以在制备cdv疫苗中应用。

15、所述的突变cdv病毒可以在cdv感染细胞模型中应用。

16、有益效果

17、本发明的第一个方面是提供一种突变的cdv h蛋白，该突变cdv h蛋白在细胞内泛素化蛋白酶体途径的降解中保持完整性。所述泛素蛋白酶体途径的泛素化降解由宿主细胞e3泛素连接酶hrd1蛋白介导。所述突变cdv h蛋白的突变位点位于cdv h蛋白上自氨基端起第115位氨基酸，是hrd1介导的cdv h蛋白泛素化位点，该位点由赖氨酸突变为精氨酸，使得h蛋白不能被e3泛素连接酶hrd1介导的泛素化蛋白酶体途径降解。

18、本发明通过反向遗传拯救突变cdv病毒，使其h蛋白发生k115r突变。其制备过程包括：通过点突变pcr对h蛋白进行k115r突变，重叠pcr将k115r突变的h蛋白基因引入cdv基因组序列，同时在该基因组序列两端引入锤头核酶及丁肝核酶序列，然后连接到pci质粒，以cdvn、p、l蛋白质粒作为辅助质粒共转染细胞，拯救出突变病毒。用上述突变的cdv病毒感染vero细胞，病毒的复制能力增强，病毒滴度提高。用上述突变的cdv h蛋白作为dna疫苗，免疫小鼠，增加了cdvh蛋白的抗体水平。用上述突变的cdv病毒免疫犬，提高了中和抗体水平，增强了免疫效果。

19、本发明具有以下有益效果：

20、本发明是基于宿主e3泛素连接酶hrd1介导cdv h蛋白自氨基端起第115位氨基酸位点发生泛素化修饰而通过蛋白酶体途径降解的发现。

21、通过制备不能被hrd1蛋白介导的泛素化蛋白酶体途径降解的突变cdv h蛋白、突变cd病毒，从而维持cdvh蛋白的稳定水平和获得具有高复制能力的突变cdv病毒，其毒价显著高于原有cdv毒株，可以作为更优良的疫苗候选抗原，为cdv暴发提供潜在的控制措施。

22、本发明构建的115位氨基酸位点突变的cdv h蛋白制备成dna疫苗，通过泛素化试验证实hrd1不能介导突变cdv h蛋白的泛素化降解作用，能维持h蛋白在细胞中的稳定性，增强犬瘟热的免疫保护效果；

23、本发明构建的h蛋白不能被hrd1泛素化降解的突变cdv病毒，制备成dna疫苗感染犬后能使动物体内抗体水平明显升高；突变的cdv通过细胞感染实验发现突变的cdv病毒毒价显著高于原有毒株，感染犬后相比原有cdv病毒载量显著提升，也能增加抗体水平，完全可以替代原有疫苗株cdv来创制cdv疫苗，并对cdv防控药物的研发有着重要的意义。

技术特征：

1.一种不受hrd1泛素化降解的突变cdvh蛋白，其特征在于：该突变cdvh蛋白在细胞的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解中保持完整性。

2.根据权利要求1所述的突变cdvh蛋白，其特征在于：所述的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解是由宿主hrd1蛋白介导，所述的突变cdvh蛋白的突变氨基酸位点位于cdvh蛋白上自氨基端起第115位氨基酸。

3.根据权利要求1或2所述的突变cdvh蛋白，其特征在于：所述的突变cdvh蛋白是发生k115r突变的cdvh蛋白。

4.含有权利要求1-3之一所述突变cdvh蛋白的突变cdv病毒，其特征在于：该突变cdv病毒的h蛋白在细胞的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解中保持完整性。

5.根据权利要求4所述的突变cdv病毒，其特征在于：所述的泛素化蛋白酶体途径的泛素化降解是由宿主hrd1蛋白介导，所述的突变cdv病毒的突变氨基酸位点位于cdvh蛋白上自氨基端起第115位氨基酸。

6.根据权利要求4或5所述的突变cdv病毒，其特征在于：所述的突变cdv病毒是h蛋白发生k115r突变的cdv病毒。

7.权利要求5或6所述的突变cdv病毒的制备方法，其特征在于：通过点突变pcr对cdv病毒的h蛋白进行k115r突变，重叠pcr将k115r突变的h蛋白基因引入cdv基因组序列，同时在该基因组序列两端引入锤头核酶及丁肝核酶序列，然后连接到pci质粒，与cdv n、p、l蛋白质粒为辅助质粒共转染细胞，即为制备的不受hrd1泛素化降解的突变cdv病毒。

8.权利要求1-3之一所述的突变cdvh蛋白在制备cdv疫苗中的应用。

9.权利要求4-6之一所述的突变cdv病毒在制备cdv疫苗中的应用。

10.权利要求4-6之一所述的突变cdv病毒在cdv感染细胞模型中的应用。

技术总结
本发明涉及一种不受Hrd1泛素化降解的突变CDVH蛋白、突变CDV病毒及应用，属于生物技术领域。对CDVH蛋白的第115位点氨基酸进行K115R突变，使得突变的CDVH蛋白不能被E3泛素连接酶Hrd1介导的泛素蛋白酶体途径泛素化降解，通过反向遗传技术拯救CDVH蛋白K115R突变的病毒，该突变病毒H蛋白不能被E3泛素连接酶Hrd1介导的泛素蛋白酶体泛素化降解，病毒滴度高于原有毒株。突变的CDVH蛋白和突变的病毒作为疫苗抗原，能够提高抗体水平，增强免疫效果，为CDV的疫病防控提供潜在的控制措施。

技术研发人员：毕振威,王文杰,徐立波,宋素泉
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13