一种乌鳢显微注射的方法及应用

本发明属于水产动物遗传育种和功能基因验证研究领域，尤其涉及一种乌鳢显微注射的方法及应用。

背景技术：

1、乌鳢(channa argus)隶属鲈形目(perciformes)、鳢科(channidae)、鳢属(channa)，俗称黑鱼、生鱼、乌鱼、财鱼等，是我国重要的淡水经济鱼类，分布范围较广，北至黑龙江流域南至四川、云南、广东。乌鳢体色较深呈灰黑色，头部和体背侧对称排列的不规则斑块。金乌鳢(albino channa argus)是野生乌鳢体色相关基因突变产生的一种白化品系，与之前报道四川省嘉陵江中下游流域出现的白甲乌鳢不同的是金乌鳢体表呈金黄色，眼球为深红色，金乌鳢与野生乌鳢两者除体色以及眼球颜色差异外极其相似，金乌鳢因其通体金黄色具有较高的市场价值。

2、近年来，我国多种经济鱼类遗传育种工作相继开展，而乌鳢也培育出了多个新品种，如“玉龙1号”、“雄鳢1号”等。然而目前乌鳢的遗传育种工作还主要基于传统的人工选育方法，全基因组选择育种及分子辅助选择育种等技术在乌鳢遗传育种中还并未得到真正应用，这其中主要限制因素是大部分基因的功能尚不清楚。目前乌鳢中开展的基因功能研究，主要限于基因克隆和表达模式分析。

3、在高等动物和模式动物中，显微注射技术在基因功能研究中已得到广泛应用，从早期的talens、zfns基因编辑，到近几年的crispr/cas9基因编辑技术。利用基因编辑和转基因技术研究者阐明了越来越多的基因功能，而显微注射技术是进行鱼类转基因或者基因编辑的经典手段，适合采用显微注射法的鱼卵具有卵壳柔软、透明、沉性卵，而且动物极清晰的特点。但是，乌鳢受精卵为浮性卵，卵内压较大，且动物极在下方难以翻转，存在不适宜进行胚胎显微操作的问题。

技术实现思路

1、本发明实施例的目的在于提供一种乌鳢显微注射的方法，旨在解决背景技术中提出的问题。

2、针对上述问题，本发明提供了一种乌鳢显微注射的方法，可以利用该方法对乌鳢进行基因转移以及基因的精准编辑，为开展乌鳢基因的功能研究和乌鳢养殖品种的遗传改良提供了强有力的技术手段。

3、具体的，本发明实施例是这样实现的，一种乌鳢显微注射的方法，其包括以下步骤：

4、以靶基因的反义吗啉环寡核苷酸(mo)或外源mrna作为注射试剂；

5、将注射试剂与注射指示剂进行混合，得到混合物；

6、在乌鳢卵子受精后的30分钟内向单细胞期的乌鳢受精卵进行显微注射，将混合物导入乌鳢受精卵中。

7、作为本发明的一个优选方案，外源mrna为体外转录乌鳢slc45a2 mrna；乌鳢slc45a2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

8、作为本发明的一个优选方案，靶基因的反义吗啉环寡核苷酸的核苷酸序列如seqid no.2所示。

9、作为本发明的一个优选方案，所述注射指示剂为酚红溶液。

10、作为本发明的一个优选方案，所述混合物中，反义吗啉环寡核苷酸的终浓度为0.5-1.5mm，或外源mrna的终浓度为150-250ng/μl。

11、作为本发明的一个优选方案，乌鳢受精卵的制备方法包括以下步骤：

12、挑选性成熟的雌雄乌鳢亲鱼分别暂养在养殖系统中，注射绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物混合物进行人工催产繁殖；

13、隔20-28小时，雌性乌鳢再注射双羟孕酮，注射20-28小时后，分别挤出精液和卵子到无菌干燥的环境中加入danieau缓冲液进行人工授精，缓慢晃动混匀，静置，受精完成即可得到单细胞期的乌鳢受精卵。

14、作为本发明的一个优选方案，雌性乌鳢的绒毛膜促性腺激素注射剂量为1800-2200iu/kg体重，雄性乌鳢剂量减半；雌性乌鳢的促黄体素释放激素类似物注射剂量为4-6μg/kg体重，雄性乌鳢剂量减半；雌性乌鳢的双羟孕酮注射剂量为1-3mg/kg体重。

15、作为本发明的一个优选方案，所述乌鳢包括乌鳢及其体色变异品系金乌鳢。

16、作为本发明的一个优选方案，导入的方法为：使用外径为1.0mm、内径0.75mm、尖端长度2.0-2.5mm、尖端内径为2-3μm的注射毛细管针进行注射。

17、本发明实施例的另一个目的在于提供一种上述方法在乌鳢基因敲降或乌鳢外源基因转入中的应用。

18、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

19、显微注射技术是进行鱼类转基因或者基因编辑的经典手段，适合采用显微注射法的鱼卵具有卵壳柔软、透明、沉性卵，而且动物极清晰的特点。但是，乌鳢受精卵为浮性卵，卵内压较大，且动物极在下方难以翻转，存在不适宜进行胚胎显微操作的问题。针对上述问题，申请人发现从上方穿过卵黄可从动物极背侧导入，注射毛细管针尖端长度2.0-2.5mm，尖端内径2-3μm，可以成功实施显微注射操作。

20、目前没有任何乌鳢受精卵的显微注射相关技术报道，本发明提供了一种乌鳢显微注射的方法，利用显微注射方法成功的将mo或mrna导入至乌鳢受精卵，并最终获得了乌鳢基因敲降和表型回救个体，首次建立了乌鳢的基因显微注射技术，为以后开展乌鳢基因的功能研究和遗传改良提供了强有力的技术基础。

技术特征：

1.一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，外源mr na为体外转录乌鳢slc45a2 mrna；乌鳢slc45a2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，靶基因的反义吗啉环寡核苷酸的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4.根据权利要求1所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，所述注射指示剂为酚红溶液。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，所述混合物中，反义吗啉环寡核苷酸的终浓度为0.5-1.5mm，或外源mrn a的终浓度为150-250ng/μl。

6.根据权利要求1所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，乌鳢受精卵的制备方法包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，雌性乌鳢的绒毛膜促性腺激素注射剂量为1800-2200iu/kg体重，雄性乌鳢剂量减半；雌性乌鳢的促黄体素释放激素类似物注射剂量为4-6μg/kg体重，雄性乌鳢剂量减半；雌性乌鳢的双羟孕酮注射剂量为1-3mg/kg体重。

8.根据权利要求1所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，所述乌鳢包括乌鳢及其体色变异品系金乌鳢。

9.根据权利要求1所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，导入的方法为：使用外径为1.0mm、内径0.75mm、尖端长度2.0-2.5mm、尖端内径为2-3μm的注射毛细管针进行注射。

10.一种如权利要求1-9中任一项所述方法在乌鳢基因敲降或乌鳢外源基因转入中的应用。

技术总结
本发明适用于水产动物遗传育种和功能基因验证研究领域，提供了一种乌鳢显微注射的方法及应用，其中，乌鳢显微注射的方法包括以下步骤：以靶基因的反义吗啉环寡核苷酸或外源mRNA作为注射试剂；将注射试剂与注射指示剂进行混合，得到混合物；在乌鳢卵子受精后的30分钟内向单细胞期的乌鳢受精卵进行显微注射，将混合物导入乌鳢受精卵中。该方法是第一次建立乌鳢胚胎的显微注射方法，并首次应用于反义吗啉环寡核苷酸基因敲降和构建外源mRNA表达模型，该技术既可用于研究乌鳢基因功能，又能用于精准修饰乌鳢内源基因，为乌鳢的基因改良遗传育种提供强有力的技术支持。

技术研发人员：孙冬磊,李昀,齐鑫,温海深,李建龙,朱明鑫,陶泽鑫
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13