用于二代测序的甲基化靶标检测的探针组、方法及系统与流程

本发明涉及基因检测领域，具体地涉及应用于二代测序平台上的甲基化靶标的捕获富集检测，特别是用于二代测序的甲基化靶标检测的探针组、方法及系统。

背景技术：

1、dna甲基化是指生物体在dna甲基转移酶(dna methyltransferase，dmt)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(sam)为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程，最常见的是在胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶(5-mc)。

2、dna的甲基化是一种表观调控修饰，可以在不改变碱基序列的情况下参与调控蛋白质的合成。这主要是由于cpg岛的超甲基化改变了dna区域构象，影响蛋白与dna的相互作用从而影响转录效率，而启动子区域的甲基化会使基因表达沉默。根据有关文献报道，dna甲基化和癌症高度相关，启动子区域的甲基化会使抑癌基因沉默，因此，甲基化可作为一种肿瘤筛查，诊断和预后的生物标志物。目前dna甲基化检测方法大多基于亚硫酸氢盐处理(bs)，经亚硫酸氢钠处理后，未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶不变。

3、针对肿瘤的早期筛查，需要对大量的、特定的位点的甲基化程度进行检测，同时要达到单核苷酸分辨率，对于这种需求，可以选择bs处理后进行单链建库，再进行靶向捕获结合二代测序的策略。虽然该策略具有高通量，单核苷酸分辨率，dna投入量低的优势，但该策略仍存在一些问题，在探针捕获前会对dna进行bs处理，序列中未甲基化的c会转化成t，dna序列的复杂度降低，gc含量变低，这样会使探针设计变得困难，还会影响捕获效率，降低靶标区域的覆盖深度，而肿瘤早筛对灵敏度有很高的要求。因此，目前仍亟需一种基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法来解决这个问题。

4、背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种用于二代测序的甲基化靶标检测的探针组、方法及系统。具体地，本发明包括以下内容。

2、本发明的第一方面，提供一种基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法，其包括：

3、(1)利用亚硫酸氢盐处理核酸样品，并进一步单链建库；

4、(2)使核酸样品与捕获探针杂交，其中捕获探针包括第一探针组和第二探针组，所述第一探针组包括与包含cpg甲基化和/或非甲基化区域的正义链和/或负义链杂交的探针，所述第二探针组包括与所述cpg甲基化和/或非甲基化区域的上游序列和/或下游序列杂交的探针；

5、(3)富集经所述捕获探针得到的核酸片段；

6、(4)测序得到所述核酸片段的核苷酸序列，通过所述核苷酸序列得到dna甲基化状态的信息。

7、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法，其中，所述捕获探针的长度为50-180bp，优选为80-140bp，还优选为120bp。

8、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法，其中，用于甲基化靶标检测的panel大小为1-500k，还优选为12-500k，进一步优选为100-500k，例如100、200、300、400、500k。

9、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法，其中，所述第二探针组覆盖的序列与第一探针组覆盖的序列之间的距离为x个碱基，其中x≥0，还优选地，第二探针组覆盖的序列与cpg甲基化和/或非甲基化区域的距离为50以上个碱基，进一步优选60-400碱基。

10、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法，其中，步骤(2)的杂交温度为50-70℃。

11、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法，其中，所述核酸的样本量为20-40ng，且所述捕获探针的浓度为200-500fmol/μl。

12、本发明的第二方面，提供一种提高甲基化检测中捕获效率和覆盖深度的方法，其包括使用捕获探针与核酸样本进行杂交捕获的步骤，其中捕获探针包括第一探针组和第二探针组，所述第一探针组包括与包含cpg甲基化和/或非甲基化区域的正义链和/或负义链杂交的探针，所述第二探针组包括与所述cpg甲基化和/或非甲基化区域的上游序列和/或下游序列杂交的探针。

13、本发明的第三方面，提供一种基于二代测序技术的甲基化靶标检测的探针组，所述探针组包括第一探针组和第二探针组，所述第一探针组包括与包含cpg甲基化和/或非甲基化区域的正义链和/或负义链杂交的探针，所述第二探针组包括与所述cpg甲基化和/或非甲基化区域的上游序列和/或下游序列杂交的探针。

14、本发明的第四方面，提供一种基于二代测序技术的甲基化靶标检测的试剂盒，其包括本发明第三方面所述的探针组。

15、本发明的第五方面，提供一种基于二代测序技术的甲基化靶标检测的装置，其包括：

16、碱基转换单元，其通过亚硫酸氢盐处理进行核酸样品中的碱基转换；

17、测序数据获取单元，其用于获取所述测序数据，所述测序数据包含通过本发明所述的探针组或试剂盒中的捕获探针(第一探针组和第二探针组中的探针)得到目的片段的核苷酸序列；

18、数据处理单元，所述数据处理单元通过对所述测序数据进行数据处理得到dna甲基化状态的信息；和

19、可选地，输出单元，其用于输出并显示dna甲基化状态的信息。

20、本发明为了提高捕获效率，首先优化了探针设计，不仅设计了覆盖靶点的探针，还设计了靶点上游以及下游探针。此外，本发明还测试并确定了合适的panel size，确保了整体捕获效率稳定。同时本发明优化了捕获体系以及杂交条件，测试并优化确定了合适的目标和探针投入比例、总dna投入量、合适的杂交和洗涤条件。综合以上探针设计、panelsize、实验条件以及合适的dna投入量等几个条件的优化，显著提高了血检甲基化捕获的捕获效率，还有靶标区域的覆盖深度。

技术特征：

1.一种基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法，其特征在于，所述捕获探针的长度为50-180bp。

3.根据权利要求2所述的基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法，其特征在于，用于甲基化靶标检测的panel大小为1-500k。

4.根据权利要求3所述的基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法，其特征在于，所述第二探针组覆盖的序列与第一探针组覆盖的序列之间的距离为x个碱基，其中x≥0。

5.根据权利要求4所述的基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法，其特征在于，步骤(2)的杂交温度为50-70℃。

6.根据权利要求5所述的基于二代测序技术的甲基化靶标检测方法，其特征在于，所述核酸的样本量为20-40ng，且所述捕获探针的浓度为200-500fmol/μl。

7.一种提高甲基化检测中捕获效率和覆盖深度的方法，其特征在于，包括使用捕获探针与核酸样本进行杂交捕获的步骤，其中捕获探针包括第一探针组和第二探针组，所述第一探针组包括与cpg甲基化和/或非甲基化区域杂交的探针，所述第二探针组包括与所述cpg甲基化和/或非甲基化区域的上游序列和/或下游序列杂交的探针。

8.一种基于二代测序技术的甲基化靶标检测的探针组，其特征在于，所述探针组包括第一探针组和第二探针组，所述第一探针组包括与cpg甲基化和/或非甲基化区域杂交的探针，所述第二探针组包括与所述cpg甲基化和/或非甲基化区域的上游序列和/或下游序列杂交的探针。

9.一种基于二代测序技术的甲基化靶标检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的探针组。

10.一种基于二代测序技术的甲基化靶标检测的装置，其特征在于，其包括：

技术总结
本发明公开用于二代测序的甲基化靶标检测的探针组、方法及系统，该方法包括：利用亚硫酸氢盐处理核酸样品，并进一步单链建库；使核酸样品与捕获探针杂交；富集经捕获探针得到的核酸片段；测序得到该核酸片段的核苷酸序列，通过核苷酸序列得到DNA甲基化状态的信息。本发明的方法能够满足对肿瘤的早期筛查中大量、特定位点的甲基化检测，同时显著提高了探针捕获效率以及对靶标区域的覆盖深度，从而满足肿瘤早筛对于灵敏度的要求。

技术研发人员：孙雪,赵颖,刘星宇,王伟伟,田埂
受保护的技术使用者：北京元码医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13