抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的全人源Hla单克隆抗体及其应用

本发明涉及抗体领域，具体涉及抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的全人源hla单克隆抗体，还涉及该抗体的应用。

背景技术：

1、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是一种多功能病原体，是医院和社区获得性感染的常见原因。虽然大多数金黄色葡萄球菌感染表现为皮肤和软组织感染，但该病原体也可导致更具侵袭性和威胁生命的疾病，如脓毒症、心内膜炎和肺炎。多重耐药菌株特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus,mrsa)在医院和社区的出现和传播使治疗干预变得越来越困难和昂贵，目前mrsa感染已成为全球icu病房、术后感染、烧伤及战创伤等感染率最高的院内感染病原菌之一。由于新开发的抗生素很少，人们对探索主动和被动免疫介导的治疗方法产生了相当大的兴趣和努力，以预防和治疗金葡菌感染。

2、金黄色葡萄球菌有一个强大的毒力因子库，代表了主动免疫和被动免疫治疗的潜在靶点。α-毒素是金黄色葡萄球菌中最早被鉴定和研究得最好的金葡菌成孔毒素之一。低浓度时，毒素诱导产生促炎介质，促进上皮屏障的破坏，至少部分是通过结合和激活adam10，导致e-钙粘蛋白的分裂和细胞间粘附连接的破坏；高浓度时，α-毒素会形成复合物，在易感宿主细胞膜上形成孔，导致离子梯度的破坏、膜完整性的丧失和直接裂解。充分组装的α-毒素为七聚体孔，每个单体提供两天β-链组成跨膜β-桶。

3、目前针对α-毒素相关症状没有特定的药物治疗，研究提出了多种治疗方法，包括针对其受体的小分子抑制剂、疫苗或靶向α-毒素的单抗或多克隆抗体。本发明抗体通过金黄色葡萄球菌脓毒症感染致死模型和金黄色葡萄球菌肺炎感染致死模型进行保护性评价，实验结果表明，脓毒症模型中，800μg抗体能够保护70％小鼠，400μg抗体能够保护40％小鼠；肺炎模型中，800μg抗体能够保护80％小鼠，400μg抗体能够保护50％小鼠，此结果表明，全人源抗金葡菌α-毒素抗体能够抑制疾病进展、增强清除并且抑制细菌或相关毒素的全身扩散，有效保护balb/c小鼠免遭mrsa感染引起的脓毒血症和肺炎。因此，以抗体药物为核心的被动免疫治疗mrsa感染具有巨大的发展应用前景，或可成为“非抗生素”治疗mrsa感染和控制耐药性发展的新的免疫防治手段。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的全人源hla单克隆抗体；本发明的目的之二在于提供编码所述全人源hla单克隆抗体的核苷酸序列；本发明的目的之三在于提供含有所述核苷酸序列的载体或宿主细胞；本发明的目的之四在于提供一种生产全人源hla单克隆抗体的方法；本发明的目的之五在于提供所述全人源hla单克隆抗体在制备特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素或游离的α-溶血素的试剂中的应用；本发明的目的之六在提供所述全人源hla单克隆抗体在制备治疗、预防或诊断金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的全人源hla单克隆抗体，所述全人源hla单克隆抗体包括重链和轻链，所述重链的可变区cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列如seq id no.1、seqid no.2、seq id no.3所示；所述轻链的可变区cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列如seq idno.4、snn、seq id no.5所示。

4、本发明优选的，所述抗体的恒定区包括人源iga、igd、ige、igg或igm恒定区中的任意一种，优选为igg中igg1；和或，包含但不限于或由vl/vh区域对和抗体恒定域组成的抗体，如scfv、fab、f(ab′)2或fv特定抗体等。

5、本发明优选的，所述重链的氨基酸序列如seq id no.6所示；所述轻链的氨基酸序列如seq id no.7所示。

6、本发明优选的，所述全人源hla单克隆抗体特异结合金黄色葡萄球菌α-溶血素或金黄色葡萄球菌α-溶血素突变体；所述金黄色葡萄球菌α-溶血素的氨基酸如seq id no.10所示；所述金黄色葡萄球菌α-溶血素突变体的序列如seq id no.11所示。

7、本发明优选的，所述全人源hla单克隆抗体与α-溶血素结合的平衡解离常数不高于1×10-8m，比如1×10 -9m、1×10 -10m、1×10 -11m或以更小的kd与金黄色葡萄球菌α-溶血素解离。其中，术语“kd”是指特定抗原-抗体相互作用的平衡解离常数，表示处于平衡状态时抗体和抗原的解离程度。kd越小说明解离越小，代表抗体和抗原的亲和力越强。

8、本发明中，人源性单克隆抗体自严重感染金黄色葡萄球菌的血液淋巴细胞产生，并且如此生成具有高亲和力的天然精制的且选定的抗体以实现中和和针对感染的有效保护。

9、2、编码所述全人源hla单克隆抗体的核苷酸序列。

10、3、含有所述核苷酸序列的载体或宿主细胞；所述宿主细胞如酵母细胞、sf9昆虫细胞、cho细胞和hek293细胞等，特别优选的是人生产细胞系，较佳地，优选hek293f细胞。

11、4、一种生产全人源hla单克隆抗体的方法，所述抗体含有重链和轻链，将含有编码所述核苷酸序列宿主细胞进行培养，收集表达的抗体，并通过protein a/g进行分离纯化得到；编码所述核苷酸序列如seq id no.11所示。

12、5、所述全人源hla单克隆抗体在制备特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素或游离的α-溶血素的试剂中的应用。

13、6、所述全人源hla单克隆抗体在制备治疗、预防或诊断金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。

14、本发明的有益效果在于：本发明公开了抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的全人源hla单克隆抗体，该抗体通过培养转入信号序列的表达载体的宿主细胞来生成单克隆抗体，生成的单克隆抗体被分泌入上清液中，并且可以通过应用常规的层析技术分离纯化，优选用protein a/g进行分离纯化，制得的抗体可用于诊断或测定α-溶血素，并且是有效的，并且所述抗体还可以预防或治疗由mrsa感染所引起的脓毒血症、肺炎，对金葡菌的预防、治疗和检测均具有重要意义。

技术特征：

1.抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的全人源hla单克隆抗体，其特征在于：所述全人源hla单克隆抗体包括重链和轻链，所述重链的可变区cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列如seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3所示；所述轻链的可变区cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列如seq id no.4、snn、seq id no.5所示。

2.根据权利要求1所述抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的全人源hla单克隆抗体，其特征在于：所述抗体的恒定区包括人源iga、igd、ige、igg或igm恒定区中的任意一种。

3.根据权利要求1所述抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的全人源hla单克隆抗体，其特征在于：所述重链的氨基酸序列如seq id no.6所示；所述轻链的氨基酸序列如seq id no.7所示。

4.根据利要求1所述抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的全人源hla单克隆抗体，其特征在于：所述全人源hla单克隆抗体特异结合金黄色葡萄球菌α-溶血素或金黄色葡萄球菌α-溶血素突变体；所述金黄色葡萄球菌α-溶血素的氨基酸如seq id no.10所示；所述金黄色葡萄球菌α-溶血素突变体的序列如seq id no.11所示。

5.根据利要求1所述抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的全人源hla单克隆抗体，其特征在于：所述全人源hla单克隆抗体与α-溶血素结合的平衡解离常数不高于1×10-8m。

6.编码权利要求1～5任一项所述全人源hla单克隆抗体的核苷酸序列。

7.含有权利要求6所述核苷酸序列的载体或宿主细胞。

8.一种生产全人源hla单克隆抗体的方法，所述抗体含有重链和轻链，其特征在于，将含有编码权利要求6所述核苷酸序列宿主细胞进行培养，收集表达的抗体，并通过proteina/g进行分离纯化得到。

9.权利要求1～5任一项所述全人源hla单克隆抗体在制备特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素或游离的α-溶血素的试剂中的应用。

10.权利要求1～5任一项所述全人源hla单克隆抗体在制备治疗、预防或诊断金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了抗金黄色葡萄球菌α‑溶血素的全人源Hla单克隆抗体及其应用，该抗体重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SNN、SEQ ID NO.6所示；该抗体能够特异性结合金黄色葡萄球菌α‑溶血素或游离的α‑溶血素，可以用于治疗、预防或诊断金黄色葡萄球菌感染等用途，将可成为“非抗生素”治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染和控制耐药性发展研究领域的重要方向。

技术研发人员：曾浩,赵莉群,宋振,曾小强,苟强,陈致富,袁月,张卫军,鲁东水,邹全明
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13