一种蔗糖磷酸化酶及其在糖基化反应中的应用的制作方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种蔗糖磷酸化酶及其在糖基化反应中的应用。

背景技术：

1、糖基化反应通过在一些小分子的羟基端添加诸如葡萄糖之类的糖类能够改变这些化合物的物理化学特性，包括提升一些疏水化合物的水溶性、提升一些药物的药效特性、改变一些抗生素类的抗菌谱以及改善一些香精香料的气味等。例如，当槲皮素和白藜芦醇转化为其糖苷衍生物时，能够显著增强其水溶性，从而使得其药学性质得到有效地利用。薄荷醇转化为其葡萄糖苷衍生物时能够在口中缓慢释放香味，从而达到香气持久的效果。氢醌具有抗氧化、稳定、还原的作用，可以阻止色斑的产生，对已有的色素还有消退的作用，因此在医学上被用作美白软膏，治疗黄褐斑、雀斑等。但是氢醌对皮肤刺激性强，副作用大，而其葡萄糖苷衍生物由于局部使用刺激性小，从而能够比较好地解决这一问题。

2、蔗糖磷酸化酶能够以蔗糖作为辅助底物，催化多羟基化合物的糖基化反应，得到相应的葡萄糖苷。由于蔗糖磷酸化酶在糖基化反应中发挥着重要作用，得到一种具有高酶活和高选择性的酶在工业化生产中具有重要价值。

技术实现思路

1、针对现有技术中的问题，本发明提供一种蔗糖磷酸化酶，其能够催化多羟基化合物和蔗糖发生糖基化反应，并且该反应选择性高，能够得到成分单一的糖基化产物，实现目标产物的高效生产。

2、为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：

3、本发明提供一种蔗糖磷酸化酶在多羟基化合物的糖基化反应中的应用，所述蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列为seq id no.2所示，编码的氨基酸序列如seq id no.8所示。所述蔗糖磷酸化酶来源于肠膜明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)。

4、进一步，为了得到本发明所述能够高效催化糖基化反应的蔗糖磷酸化酶，筛选了6种不同来源的蔗糖磷酸化酶，包括来源于青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)、肠膜明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)、嗜糖假单胞杆菌(pseudomonas saccharophila)、变异链球菌(streptococcus mutans)、短双歧杆菌(bifidobacterium breve)以及嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)的蔗糖磷酸化酶，分别命名为baspase、lmspase、psspase、smspase、bbspase和laspase。对这六种蔗糖磷酸化酶基因针对大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化，优化后的基因序列分别如seqid no.1～seq id no.6所示，对应的氨基酸序列如seq id no.7～seq id no.12所示。

5、进一步，为了对比六种蔗糖磷酸化酶的催化性能，将这六种蔗糖磷酸化酶基因克隆至大肠杆菌中并进行表达。所述大肠杆菌的构建方法为：将seq id no.1～seq id no.6所示的蔗糖磷酸化酶基因克隆至pet28a质粒上，并转化入e.coli bl21(de3)宿主细胞中，得到重组大肠杆菌。接着，在摇瓶中培养得到的重组大肠杆菌并诱导表达蔗糖磷酸化酶。对培养得到的重组大肠杆菌测定蔗糖磷酸化酶酶活。其中糖基化反应酶活高的蔗糖磷酸化酶用于糖基化产物的制备。

6、进一步，本研究所述的重组大肠杆菌的摇瓶培养方法为：挑选重组大肠杆菌单菌落接种至含有5ml lb培养基(加入终浓度50μg/ml卡那霉素)的25ml培养管中，37℃、220rpm培养12h。然后，转移2ml培养的种子液接种至含100ml lb培养基(加入终浓度50μg/ml卡那霉素)的500ml摇瓶中，37℃、220rpm培养至od600为0.6-0.8后，培养温度降低至25℃，加入终浓度为18-22g/l的乳糖，继续培养16h后，离心收获培养的菌体。获得的菌体用50mm磷酸缓冲液(ph 6.5)重悬后用于酶活的测定。

7、本发明所述的蔗糖磷酸化酶在多羟基化合物的糖基化反应中的应用方法为：将含有蔗糖磷酸化酶基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液经过离心分离获得湿菌体。得到的湿菌体用缓冲液重悬后作为催化剂，以多羟基化合物为底物，以蔗糖为辅助底物，在反应温度30-45℃、ph7.0的条件下进行催化反应。当反应进行12h后，在反应体系中补加100g/l的蔗糖并继续反应；当反应进行24h后，在反应体系中继续补加50g/l的蔗糖，总反应时长为48-60h。

8、进一步，所述发酵液或者菌悬液的湿菌体含量为5-100g/l(优选30-50g/l)、多羟基化合物的终浓度为20-200g/l(优选50-100g/l)，蔗糖的终浓度为350-450g/l(优选400g/l)。

9、进一步，所述多羟基化合物具有如图1所示的分子结构。

10、进一步，本发明所述大肠杆菌的发酵培养方法为：(1)将含有蔗糖磷酸化酶基因的重组大肠杆菌接种在含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，30-37℃，100-300rpm培养至对数中期后，获得种子培养液。所述的lb培养基组成为：酵母粉5g/l、大豆胨10g/l、nacl 10g/l，溶剂为去离子水，自然ph。(2)发酵培养：得到的种子培养液按5％比例接种至含0.0005ml/l消泡剂的发酵培养基中，在30-37℃培养5-7h后，开始不断添加补料培养基，继续培养7h后，加入终浓度为18-22g/l的乳糖，培养温度降低至22-25℃后，继续发酵培养12-20h，获得发酵培养液。所述发酵培养基组成为：酵母粉10g/l、甘油10g/l、(nh4)2so4 8g/l、kh2po4 2.5g/l、na2hpo4·2h2o13g/l、mgso4 0.3g/l、feso4·7h2o 0.11g/l、柠檬酸0.005g/l、mncl2·4h2o 0.02g/l、cuso4·5h2o 0.002g/l、na2moo4·2h2o 0.002g/l、znso4·7h2o0.02g/l、cacl2·2h2o 0.015g/l。

11、与现有报道技术相比，本发明有益效果主要体现在：

12、1)本发明筛选得到的蔗糖磷酸化酶酶活高，以催化多羟基化合物a为例，能够在60h内催化得到>170g/l的糖基化产物化合物b；

13、2)本发明得到的蔗糖磷酸化酶在糖基化反应中能够生产得到单一的产物，具有高度区域和立体专一糖基化的特点；以如图2所示的多羟基化合物a为例，本发明的蔗糖磷酸化酶能够催化其得到只含化合物b的糖基化产物；

14、3)该催化反应底物转化率高，以催化化合物a为例，化合物a的转化率达到90.7％。

技术特征：

1.一种蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列为seq id no.8所示。

2.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶编码基因的核苷酸序列为seq id no.2所示。

3.权利要求1-2任一所述蔗糖磷酸化酶在糖基化反应中的应用。

4.根据权利要求3所述蔗糖磷酸化酶在糖基化反应中的应用，其特征在于，以多羟基化合物为底物，以蔗糖为辅助底物，加入权利要求1-2所述蔗糖磷酸化酶的粗酶液作为催化剂，在温度为30-45℃、ph为6.5-8.0的条件下进行反应，获得所需的糖基化产物。

5.根据权利要求4所述蔗糖磷酸化酶在糖基化反应中的应用，其特征在于，所述粗酶液的制备方法包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述蔗糖磷酸化酶在糖基化反应中的应用，其特征在于，步骤s2中所述lb培养基组成为：酵母粉5g/l、大豆胨10g/l、nacl 10g/l，卡那霉素50μg/ml，溶剂为去离子水，自然ph。

7.根据权利要求5所述蔗糖磷酸化酶在糖基化反应中的应用，其特征在于，步骤s2所述发酵培养基组成为：酵母粉10g/l、甘油10g/l、(nh4)2so4 8g/l、kh2po4 2.5g/l、na2hpo4·2h2o 13g/l、mgso40.3g/l、feso4·7h2o 0.11g/l、柠檬酸0.005g/l、mncl2·4h2o 0.02g/l、cuso4·5h2o 0.002g/l、na2moo4·2h2o 0.002g/l、znso4·7h2o0.02g/l、cacl2·2h2o0.015g/l。

8.根据权利要求5所述蔗糖磷酸化酶在糖基化反应中的应用，其特征在于，步骤s2所述补料培养基组成为：甘油600g/l、mgso45g/l、酵母粉60g/l。

9.根据权利要求5所述蔗糖磷酸化酶在糖基化反应中的应用，其特征在于，所述粗酶液的湿菌体含量为5-100g/l，多羟基化合物的终浓度为20-200g/l，蔗糖的终浓度为350-450g/l。

10.根据权利要求5所述蔗糖磷酸化酶在糖基化反应中的应用，其特征在于，所述粗酶液的湿菌体含量为30-50g/l，多羟基化合物的终浓度为50-100g/l，蔗糖的终浓度为400g/l。

技术总结
本发明公开了一种蔗糖磷酸化酶，所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列为SEQ ID No.8所示，所述蔗糖磷酸化酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；使用时，以多羟基化合物为底物，以蔗糖为辅助底物，加入蔗糖磷酸化酶的粗酶液作为催化剂，在温度为30‑45℃、pH为6.5‑8.0的条件下进行反应，获得所需的糖基化产物；本发明提供一种蔗糖磷酸化酶，其能够催化多羟基化合物和蔗糖发生糖基化反应，并且该反应选择性高，能够得到成分单一的糖基化产物，实现目标产物的高效生产。

技术研发人员：焦松
受保护的技术使用者：杭州佳嘉乐生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12