耐血清性双巯基特异性生物素化试剂的制作方法

背景技术：

1、抗体和抗体片段通常用于体外应用中的全血产品以及用于体内和临床应用，以靶向特定的细胞靶标。

2、这些生物分子的生物素化通常用于引入标签或柄(handles)，以使它们可以被第二识别系统识别，所述第二识别系统例如基于链霉亲和素、亲和素或抗生物素抗体(仅举几例)。

3、各种生物素化试剂是已知的，并例如公开在liberatore等人,bioconjugatechem.1990,1,36-50,doi:10.1021/bc00001a005,ep3620464a1或d.m.mock&a.bogusiewicz；第209页；来自:methods in molecular biology,第418卷:avidin-biotininteractions,methods and applications中。

4、从不同的技术领域来看，交联抗体的二硫桥是已知的。例如，在1979年的科技出版物sumita mitra等人,“reagents for cross-linking of proteins”,jacs 101211(1979)、liberatore f等人,bioconjugate chem,1,(1990)和rosario等人,bioconjugatechem,1990,1,51-59中首次描述了识别先前形成了二硫桥的两个相邻的还原硫醇的化学；其中交联剂被称为：平衡转移烷基化交联剂(etac)。描述了使完全抗体与交联剂反应，目的是为了用荧光染料标记该抗体。另一科技出版物描述了在fab上的类似用途(wilbur等人,bioconjugate chem 1994,5,220-235)。

5、us 2016/0000933 a1公开了在抗体的二硫桥处交联抗体以制备抗体缀合物。

6、涉及在抗体的二硫桥处交联抗体的其他出版物为例如wo 2016/168769 a1；hanieh khalili等人:“comparative binding of disuifide-bridged peg-fabs”,bioconjugate chemistry,第23卷,第11期,2012年9月21日(2012-09-21),第2262-2277页；在“bioconjugate techniques”,2013年1月1日(2013-01-01),academic press,isbn:978-0-12-382239-o,第867-920页中的greg t.hermanson:“antibody modification andconjugation”；wo 2016/154621 a1。

7、在生物素化抗体的血清相关应用(例如体内和全血体外应用)中，生物素标签需要耐受数小时。正常血清(人和小鼠)含有分解生物素酰胺的因子。此类因子的一个实例是天然存在的酶生物素酰胺酶。这种天然酶能够分解生物素酰胺，释放游离的生物素和胺。

8、因此，本发明的一个目的是提供化学成分明确的耐血清性衔接分子，其在位点特异性位置上具有每个ab和/或fab的单变量数量的标签/亲和单元(例如生物素)。

技术实现思路

1、在本文中我们描述了合成新的生物素化试剂，所述生物素化试剂耐受人血清和酶促降解((例如尤其是通过生物素酰胺酶的)。不受理论的束缚，这是由于在酰胺键的α中存在羧基基团，其特异性地防止降解。

2、本发明的试剂特异性地与两个巯基基团反应。这使其对靶向蛋白(例如抗体)中的还原二硫化物而不损失生物分子的结构或稳定性特别有吸引力，因为该试剂能够再桥接巯基基团。因此，此类生物素化抗体或抗体片段适合用于其中生物素缀合物暴露于血液、血液制品、新鲜血清或血浆样品的任何应用，所述应用未以降低或抑制分解生物素酰胺的因子活性的方式治疗，特别是还适合用于其中生物素用作标签的临床应用。

3、本发明基于使用靶向ab和/或fab上的二硫键的定点交联剂。益处依赖于：i)二硫桥的具体位置，已知其在ab和fab的序列和结构中的固定位置处；ii)交联剂共价连接到二硫桥的两个还原硫醇上，由此保留了ab和fab的天然3d结构和功能，不留下游离硫醇；iii)每个交联剂仅携带一个标签或亲和单元部分(例如生物素或硫胺素)，因此每个二硫桥将被携带一个生物素的连接体修饰，提供已知和可预测的化学计量(即fab仅在c末端处含有一个二硫桥)；iv)交联反应是定量的，意味着超过95％的ab和fab被标记；v)标记程度可以是化学计量控制的(即对于ab)；vi)交联缀合物对硫醇还原和还原环境不敏感。

4、因此，本发明的对象是根据式(i)的生物素化试剂

5、

6、其中r1＝烷基、羟基烷基、羧基烷基残基，其包含1至50个碳原子，优选包含至少一个o或n原子，例如-oh、-co2h、-ch2ch3、-ch(ch3)2、-och3、-ch2oh；

7、r2＝烷基、二醇、胺或肽残基，其具有1至50个碳原子，优选具有小于150kda的分子量；

8、r3＝芳基、杂芳基，其具有3至50个碳原子；

9、r4、r5＝芳基、杂芳基、烷基，其具有3至50个碳原子。

技术特征：

1.根据式(i)的生物素化试剂

2.根据权利要求1所述的生物素化试剂，其特征在于所述生物素化试剂具有式(ii)、(iii)、(iv)或(v)的取代模式：

3.根据权利要求1和2所述的生物素化剂用于含有至少一个二硫键的蛋白或肽的生物素化的用途。

4.根据权利要求3所述的生物素化剂的用途，其中所述蛋白含有抗原结合部分，产生其中二硫键被源自所述生物素化剂的3-碳连接桥(3-carbon linker bridge)置换和重构的蛋白或肽。

5.根据权利要求3所述的生物素化剂的用途，其中所述蛋白包含抗体片段(fab)单元，并且被所述生物素化剂修饰的所述二硫键是链间二硫键。

6.根据权利要求3所述的生物素化剂的用途，其中所述蛋白包含至少两个具有硫原子的氨基酸，并且其中所述至少两个氨基酸通过所述生物素化剂连接。

技术总结
根据式(I)的生物素化试剂其中R1＝烷基、羟基烷基或羧基烷基残基，其包含1至50个碳原子；R2＝烷基、二醇、胺或肽残基，其具有1至50个碳原子；R3＝芳基、杂芳基，其具有3至50个碳原子；R4、R5＝芳基、杂芳基、烷基，其具有3至50个碳原子。该试剂在细胞分离过程中的用途。

技术研发人员：J·福尔巴赫,T·伯克,J·米特尔斯塔特,S·达帕
受保护的技术使用者：美天施生物科技有限两合公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14