豌豆白蛋白分离肽、组合物及其用途

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及豌豆白蛋白分离肽及其组合物。

背景技术：

1、疏水性药物水溶性差，易受外界环境影响而发生降解，极大地限制了其在食品、药品中的应用；同时其胃肠道稳定性差、跨小肠上皮转运主要通过被动扩散这种低效方式进行，且大部分进入细胞后还会被特定转运蛋白识别并外排，这些原因都导致了它在人体中的吸收率低、生物利用度差。

2、近年来，食品中的蛋白质和多肽被广泛应用于疏水性药物的包封和递送。蛋白质、多肽通过肽键间的氢键作用及氨基酸残基之间的静电作用和疏水性作用等可自组装成纳米体系，然后通过氢键和疏水相互作用与疏水性药物结合，使药物被稳定的包封在纳米颗粒的核心区域，从而增强其水溶性。除此之外，多肽还可以通过增加药物跨小肠上皮细胞膜的转运方式，从而提高药物的细胞吸收，极大的增强其生物利用度。

3、豌豆蛋白是一种营养价值丰富的植物蛋白资源，相比于球蛋白，豌豆白蛋白的直链含量更多，在酶解时，其内外酶解程度会更均匀，更容易诱导进行自组装，从而成为疏水性药物的良好载体。因此，本发明旨在制备筛选出多种来源于豌豆白蛋白酶解液中的分离肽，该分离肽及其组合物可促进疏水性药物跨小肠上皮细胞膜转运和细胞吸收。

技术实现思路

1、要解决的技术问题：本发明的目的是提供豌豆白蛋白分离肽及其组合物，该分离肽及其组合物具有高疏水性和细胞吸收性，可促进疏水性药物的跨小肠上皮细胞膜转运和吸收。

2、技术方案：豌豆白蛋白分离肽，其氨基酸序列为如下任意一种或多种：

3、（1）apgtsndkvlygptpv；

4、（2）arvtvtpgatddqimdgv；

5、（3）lldyapgtsndkvlygptpv；

6、（4）frntifesgtdaa；

7、（5）lfindkyv；

8、（6）apepvldvsgkklltgv；

9、（7）apellsgkklltgveap；

10、（8）vtmvkqqatgkevtdvv；

11、（9）lsekgtakamgnltvdvv；

12、（10）pttgvprvlvtgaagolg。

13、进一步的，所述豌豆白蛋白分离肽的制备方法如下：

14、（1）豌豆白蛋白的制备：将脱脂生豌豆粉和50mm醋酸盐缓冲液混合，在4℃中连续搅拌1~1.5h后，离心取上清并用水透析，再次离心取上清液，加入硫酸铵溶液（60.8%，w/v）并搅拌2~2.5h后收集沉淀，继续透析，最后冷冻干燥24~48h；

15、（2）混合肽溶液制备：将豌豆白蛋白和水混合，4℃静置过夜，得到浓度为4.5g/l~5.5g/l的豌豆白蛋白溶液；将豌豆白蛋白溶液离心，离心条件为：离心力为4500×g，时间为10min，温度为4℃，弃去沉淀，保留上清液；将上清液调节至最适酶解条件后，加入胰蛋白酶进行酶解；向酶解液中加入胰蛋白酶抑制剂进行灭酶处理，胰蛋白酶抑制剂与上述胰蛋白酶的质量比为1:4；调节灭酶之后溶液的ph为11.9~12.1，搅拌3~5min后再调节ph为7.9~8.1，最后将所得溶液通过0.22µm的聚醚砜过滤器；

16、（3）初步分离纯化及主要肽组分确定：使用尺寸排阻色谱法对通过过滤器的溶液进行初步分离，收集不同峰值的峰溶液，然后用sds-page确定豌豆白蛋白混合肽溶液中的主要肽组分；

17、（4）分离肽序列及分子量的测定：使用液相色谱-质谱联用对主要肽组分进行鉴定，得到豌豆白蛋白分离肽分子量和氨基酸序列。

18、进一步的，步骤（1）中，所述醋酸盐缓冲液的ph为4.9，所述脱脂生豌豆粉和醋酸盐缓冲液的质量体积比为1:10；两次所述离心的条件均为：离心力为10000×g、温度为4℃、时间为30min；所述透析条件为：透析袋的截留分子量为10kda，透析时间为72h。

19、进一步的，步骤（2）中，所述最适酶解条件为：温度为35~37℃，ph值为7.8~8.0，时间为1~1.5h；所述胰蛋白酶的酶活为250u/mg，胰蛋白酶与豌豆白蛋白的质量比为1:90~1:100。

20、进一步的，步骤（3）中，所述尺寸排阻色谱法包括：柱平衡：采用3倍柱体积的超纯水（20ml）润洗凝胶色谱柱；润洗完成，待底盖出口无液体流出后，加入混合肽溶液进行洗脱，流动相为超纯水，流速为3ml/min。

21、进一步的，步骤（3）中，sds-page中蛋白质分子量标准为10~180 kda。

22、进一步的，步骤（4）中，所述液相色谱-质谱联用配备在线纳喷离子源，以乙腈（b相）和水（a相），为流动相进行梯度洗脱，柱流量控制在400nl/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kv，梯度从5%的b相起始，在55min以非线性梯度升高到80%，1min内升高到100%，维持4min。

23、进一步的，所述液相色谱-质谱中质谱仪在数据依赖采集模式下运行，扫描范围为200~1600m/z、分辨率为120000、最大注入时间为50ms。

24、一种组合物，所述组合物包含上述的豌豆白蛋白分离肽以及药学、食品或保健品上可接受的辅料。

25、上述豌豆白蛋白分离肽和/或组合物在制备促进疏水性药物跨膜转运和细胞吸收药品、食品或保健品中的用途。

26、进一步的，所述疏水性药物包括姜黄素、辣椒素、槲皮素、白藜芦醇、番茄红素、香豆素等。

27、有益效果：

28、1、本发明从豌豆中制备并筛选得到十种功能性豌豆白蛋白分离肽（apgtsndkvlygptpv、arvtvtpgatddqimdgv、lldyapgtsndkvlygptpv、frntifesgtdaa、lfindkyv、apepvldvsgkklltgv、apellsgkklltgveap、vtmvkqqatgkevtdvv、lsekgtakamgnltvdvv、pttgvprvlvtgaagolg）是纯天然的、无毒无害的植物源物质，该分离肽及其组合物具有促进疏水性药物跨小肠上皮细胞膜转运和细胞吸收的功效。

29、2、本发明通过caco-2细胞模型对这十种豌豆白蛋白分离肽组合物跨膜转运机制、促进疏水性药物细胞吸收的功能进行了探索与验证，发现该分离肽组合物不仅可以增加疏水性药物的内吞途径，如小窝蛋白介导的内吞途径、巨胞饮途径，还可以有效抑制多药耐药性蛋白转运体介导的药物外排过程，极大的促进了疏水性药物的细胞吸收。

30、3、本发明的十种功能性豌豆白蛋白分离肽还具有安全无毒、生物相容性好等优点，可应用于生物医药以及功能性食品等领域，具有良好的发展潜力。

31、

技术特征：

1.豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，其氨基酸序列为如下任意一种或多种：

2.根据权利要求1所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，所述豌豆白蛋白分离肽的制备方法如下：

3.根据权利要求2所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，步骤（1）中，所述醋酸盐缓冲液的ph为4.9，所述脱脂生豌豆粉和醋酸盐缓冲液的质量体积比为1:10；两次所述离心的条件均为：离心力为10000×g、温度为4℃、时间为30min；所述透析条件为：透析袋的截留分子量为10kda，透析时间为72h。

4.根据权利要求2所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，步骤（2）中，所述最适酶解条件为：温度为35~37℃，ph值为7.8~8.0，时间为1~1.5h；所述胰蛋白酶的酶活为250u/mg，胰蛋白酶与豌豆白蛋白的质量比为1:90~1:100。

5.根据权利要求2所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，步骤（3）中，所述尺寸排阻色谱法包括：柱平衡：采用3倍柱体积的超纯水20ml润洗凝胶色谱柱；润洗完成，待底盖出口无液体流出后，加入混合肽溶液进行洗脱，流动相为超纯水，流速为3ml/min。

6.根据权利要求2所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，步骤（3）中，所述sds-page中蛋白质分子量标准为10~180 kda。

7.根据权利要求2所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，步骤（4）中，所述液相色谱-质谱联用配备在线纳喷离子源，以乙腈：b相，和水：a相，为流动相进行梯度洗脱，柱流量控制在400nl/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kv，梯度从5%的b相起始，在55min以非线性梯度升高到80%，1min内升高到100%，维持4min。

8.根据权利要求7所述的豌豆白蛋白分离肽，其特征在于，所述液相色谱-质谱中质谱仪在数据依赖采集模式下运行，扫描范围为200~1600m/z、分辨率为120000、最大注入时间为50ms。

9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含根据权利要求1~8任意一项所述的豌豆白蛋白分离肽以及药学、食品或保健品上可接受的辅料。

10.根据权利要求1~8任意一项所述的豌豆白蛋白分离肽和/或权利要求9所述的组合物在制备促进疏水性药物跨膜转运和细胞吸收药品、食品或保健品中的用途。

技术总结
本发明提供了豌豆白蛋白分离肽、组合物及其用途，所述豌豆白蛋白分离肽的分离纯化方法如下：豌豆白蛋白的制备；混合肽溶液制备；初步分离纯化及主要肽组分确定；分离肽序列及分子量的测定。本发明提供的豌豆白蛋白分离肽及其组合物具有高疏水性，可用于疏水性药物的包封，还具有良好的生物相容性、生物可降解性以及较好的跨小肠上皮细胞膜转运效果和细胞吸收，可应用于生物医药以及功能性食品等领域，具有良好的发展潜力。

技术研发人员：季俊夫,李祎铭,赵佳佳,马玲君,陈芳,胡小松
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15