一种ABO基因扩增引物、扩增体系、扩增方法、测序文库构建方法及测序方法与流程

本公开涉及基因分型检测，具体涉及一种abo基因扩增引物、扩增体系、扩增方法、测序文库构建方法及测序方法。

背景技术：

1、1990年landsteiner发现abo血型系统，至今abo血型是人类红细胞表面表达最强且最具临床意义的抗原系统，因此，abo血型鉴定的准确性对输血医学、医学遗传学、器官移植学及法医学等具有重要的临床意义，同时可以促进精准输血，保障患者输血安全。abo血型受遗传过程中基因突变、病理状态等因素影响，导致了所表达血型抗原的复杂性和多样性，部分病例血型表型难以确定，给输血带来一定的困难，因此，需要在输血前对血液进行分型。

2、目前已应用到abo血型分型的基因分型技术包括pcr-rflp、pcr-asp、pcr-ssp、pcr实时荧光定量pcr、sanger测序法等，作为常规血清学方法的补充以上方法均可对abo等位基因进行鉴定，但是这些方法存在一个通病，通量低，因此面对大批量样本略显乏力，同时这几项测序技术虽然具备实验简单，实验周期短的优势，但此技术无法检测新的等位基因，只能对已知的血型分型进行区分。近年来，在人类snp的研究上高通量技术已十分成熟，目前已经开发了几种大规模的基因分型法(例如基因芯片、ngs)增加了筛选大量样本的可能，但因abo的基因全长长，而此技术读长短，因此组装非常依赖数据计算，同时ngs技术虽然对snv的检测准确性很高，但对于插入或缺失、svs和拷贝数变体(cnvs)相对不敏感，造成会引入大量模棱两可的结果。

3、需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

技术实现思路

1、本公开的目的在于提供一种abo基因扩增引物、扩增体系、扩增方法、测序文库构建方法及测序方法，进而至少在一定程度上克服由于相关技术的限制和缺陷而导致的传统测序方法准确度不高的情况。

2、本公开的其他特性和优点将通过下面的详细描述变得显然，或部分地通过本公开的实践而习得。

3、根据本公开的第一方面，提供了一种abo基因扩增引物，包括：第一组基因引物混合和第二组基因引物混合；

4、所述第一组基因引物混合包括：

5、第一组引物：abo-1-f、abo-1-r；

6、第二组引物：abo-3-f和abo-3-r；

7、所述第二组基因引物混合包括：

8、引物：abo-2-f和abo-2-r。

9、可选的，各引物组中的引物配比为：

10、abo-1-f、abo-1-r为0.08：0.08；

11、abo-3-f和abo-3-r为0.08：0.08；

12、abo-2-f和abo-2-r为0.05：0.05。

13、根据本公开的第二方面，提供了一种abo基因扩增体系，将上述的第一组基因引物混合以及第二组基因引物混合分别稀释至工作浓度并按照预定配比配制，abo基因扩增体系包括：第一扩增体系与第二扩增体系；

14、所述第一扩增体系包括：

15、12.5μl的kod neo fx buffer、5μl的dntps、0.32μl的第一组基因引物混合、5μl的gdna(10ng/μl)、0.5μl的kod neo fx、1.68μl的warter；所述第一扩增体系的总体积为25μl；

16、所述第二扩增体系包括：

17、12.5μl的kod neo fx buffer、5μl的dntps、0.1μl的第二组基因引物混合、5μl的gdna(10ng/μl)、0.5μl的kod neo fx、1.9μl的warter；所述第二扩增体系的总体积为25μl。

18、可选的，按照预定配比配制过程中，分别将第一扩增体系与第二扩增体系置于两个管中，分别对两个管进行扣盖混匀离心处理。

19、根据本公开的第三方面，提供了一种扩增方法，用于分别对上述的第一扩增体系、第二扩增体系进行扩增，包括：

20、对所述第一扩增体系进行扩增，得到扩增产物；其中，扩增的工作参数为：94℃，2min；98℃，12s，68℃，12min，26个循环，第11个循环开始，每循环增加30s；68℃，10min；

21、对所述第二扩增体系进行扩增，得到扩增产物；其中，扩增的工作参数为：94℃，2min；98℃，12s，68℃，12min，26个循环，第11个循环开始，每循环增加30s；68℃，10min。

22、可选的，分别对所述第一扩增体系以及所述第二扩增体系扩增后，所述方法还包括：

23、利用1％琼脂糖凝胶电泳对pcr反应后产物进行检测分析，得到扩增产物中目的基因是否扩增的检测结果；其中，检测电压：120v；检测时间：120min。

24、根据本公开的第四方面，提供了一种测序文库构建方法，包括：

25、使上述的扩增产物与接头发生连接反应、外切酶消化构建得到文库；

26、可选的，所述连接反应的条件为：37℃，40min；16℃，40min；65℃，10min。

27、可选的，所述外切酶消化反应的条件为：37℃，40min；25℃，40min；65℃，10min。

28、对所述文库进行纯化；

29、对纯化后的文库进行混库，以构建所述abo基因测序文库。

30、根据本公开的第五方面，提供了一种测序方法，采用上述的abo基因测序文库的构建方法构建的abo基因测序文库，对所述abo基因测序文库进行测序。

31、可选的，采用hifi reads模式对所述abo基因测序文库进行测序，其中，上机量为200pm，平均片段大小为10000bp。

32、本公开的提供了一种abo基因扩增引物、扩增体系、扩增方法、测序文库构建方法及测序方法，其中，abo基因扩增引物，包括：第一组基因引物混合和第二组基因引物混合；所述第一组基因引物混合包括：第一组引物：abo-1-f、abo-1-r；第二组引物：abo-3-f和abo-3-r；所述第二组基因引物混合包括：引物：abo-2-f和abo-2-r；基于本申请的abo基因扩增引物配置得到的扩增体系，对扩增体系扩增后得到扩增产物，基于扩增产物构建测序文库，hifi reads模式对所述abo基因测序文库进行测序，可以有效的提高测序结果的准确性。

33、应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。

技术特征：

1.一种abo基因引物，其特征在于，其引物序列包括：

2.一种abo基因扩增引物，其特征在于，包括：第一组基因引物混合和第二组基因引物混合；

3.根据权利要求2所述的abo基因扩增引物，其特征在于，各引物组中的引物配比为：

4.一种abo基因扩增体系，将权利要求2所述的第一组基因引物混合以及第二组基因引物混合分别稀释至工作浓度并按照预定配比配制，其特征在于，abo基因扩增体系包括：第一扩增体系与第二扩增体系；

5.根据权利要求4所述的abo基因扩增体系，其特征在于，按照预定配比配制过程中，分别将第一扩增体系与第二扩增体系置于两个管中，分别对两个管进行扣盖混匀离心处理。

6.一种扩增方法，用于分别对权利要求4或5所述的第一扩增体系、第二扩增体系进行扩增，其特征在于，包括：

7.根据权利要求6所述的扩增方法，其特征在于，分别对所述第一扩增体系以及所述第二扩增体系扩增后，所述方法还包括：

8.一种测序文库构建方法，其特征在于，包括：

9.一种测序方法，其特征在于，采用权利要求8所述的abo基因测序文库的构建方法构建的abo基因测序文库，对所述abo基因测序文库进行测序。

10.根据权利要求9所述的测序方法，其特征在于，采用hifi reads模式对所述abo基因测序文库进行测序，其中，上机量为200pm，平均片段大小为10000bp。

技术总结
本公开涉及基因分型检测技术领域，涉及一种ABO基因扩增引物、扩增体系、扩增方法、测序文库构建方法及测序方法，其中，ABO基因扩增引物，包括：第一组基因引物混合和第二组基因引物混合；所述第一组基因引物混合包括：第一组引物：ABO‑1‑F和ABO‑1‑R；第二组引物：ABO‑3‑F和ABO‑3‑R；所述第二组基因引物混合包括：引物：ABO‑2‑F和ABO‑2‑R；基于本申请的ABO基因扩增(如图3)引物配置得到的扩增体系，对扩增体系扩增后得到扩增产物，基于扩增产物构建测序文库，HiFireads模式对所述ABO基因测序文库进行测序，可以有效的提高测序结果的准确性。

技术研发人员：王博,陈超琼,张悦,何润钧,王硕
受保护的技术使用者：西安浩瑞基因技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13