一种叶酸完全抗原和抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及维生素的检测；具体地说，本发明涉及叶酸完全抗原、利用该完全抗原获得叶酸绵羊多抗及其在荧光免疫层析法检测叶酸中的应用。

背景技术：

1、叶酸 ( folic acid) 亦称蝶酰谷氨酸 ( pteroylglutamic acid，pga) ，即维生素 b11，是由喋啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸残基组成的一种水溶性b族维生素，为机体细胞生长和繁殖所必需的物质，帮助蛋白质的代谢，并与维生素b12共同促进红细胞的生成和成熟。叶酸分子结构中有3个亚基：6-甲基蝶啶、4-氨基苯甲酸和谷氨酸，相对分子质量为441。

2、叶酸是一些微生物的生长因素，是人体必不可少的营养物质，对人体具有重要的生理功能，其主要是作为甲基供体参与细胞内的甲基化反应和脱氧核糖核酸的合成，叶酸不能被人体直接利用，必需通过一系列活化才能发挥其生理功能，缺乏叶酸能引起人体异常。叶酸是一种核酸、胸苷酸、神经递质、磷脂以及激素合成必不可少的维生素类物质，在体内作为一碳单位的载体，参与各种代谢反应。叶酸还是人体必需氨基酸（蛋氨酸）的组成部分，参与基因或非基因编码的甲基化作用。一般正常人叶酸的需求量为200-400μg/d，世界卫生组织建议成人至少为200μg/d，孕妇和母乳为400μg /d[3]。口服后主要以还原型在空肠近端吸收，从空肠到结肠，其吸收率逐渐降低，吸收量为76%~93%，0.5~1.0h后达到血药峰浓度。贫血患者吸收速度较正常人快。其分布半衰期约为0.7 h，血浆蛋白结合率为50%~64%。叶酸及其降解产物通过尿液排出约62%, 粪便排出约38%。

3、叶酸并非是单一分子，是由一系列的衍生物组成。5-甲基四氢叶酸（n5-methyltetrahydrofolicacid，5mthf）是血液中叶酸最主要的存在形式，约占总量的 82%～93%。叶酸检测包括同时测定非代谢性型叶酸（unmetabolized folic acid，umfa）、四氢叶酸（tetrahydrofolicacid，thf）、5,10-亚甲基四氢叶酸、5-甲醛四氢叶酸等多种叶酸形式。血清叶酸水平受叶酸摄入量的影响，如果叶酸摄入缺乏，3周内血清叶酸浓度就会出现下降。红细胞叶酸水平能稳定保持3-4个月，检测红细胞叶酸水平能更好地反映人体的叶酸储量。二者的检测方法是相同的，但检测红细胞叶酸需要增加样本分析前处理程序，同时需要考虑红细胞压积的结果。

4、近几年来国内外学者对不同产品中叶酸含量的检测方法进行了深入的研究，根据检测对象的不同开发出了多种检测样品中叶酸的方法，如比色法、薄层层析法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、微生物法和同位素放射免疫法等。根据国家药品监督管理局中医疗器械注册产品的查询，国内有叶酸质控品3家，进口7家；国内检测仪器1家；检测试剂盒国内59家，进口6家，检测方法含化学发光免疫分析法、磁微粒化学发光法、量子点免疫荧光法、荧光免疫层析法、液相色谱-串联质谱法、免疫磁珠负向筛选+靶向荧光定量pcr法、pcr-荧光探针法、电化学发光免疫分析法。使用的样本含全血、血清、血浆。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明人经过长期而深入的研究合成了叶酸完全抗原，以此为免疫原免疫绵羊，取绵羊全血制备并纯化得到了叶酸多克隆抗体，随后利用所述完全抗原和叶酸抗体制备了灵敏度高和特异性好的叶酸免疫检测卡。

2、本发明的技术目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种叶酸完全抗原，所述完全抗原具有式1所示的结构：

4、

5、式1

6、其中，protien为载体蛋白。

7、作为优选，所述蛋白质载体为选自下组中的任何一种蛋白质：牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)、钥孔血蓝蛋白(klh)、人血清白蛋白(hsa)及人工合成的多聚赖氨酸(pll)。

8、一种制备所述叶酸完全抗原的方法，包括步骤：

9、(1)将叶酸半抗原与牛血清白蛋白（bsa）连接，以制得权利要求1所述的完全抗原；

10、(a)使叶酸半抗原与n-（3-二甲基氨基丙基）-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、n-hydroxysuccinimide（nhs)活化反应，得反应物a液，活化反应温度为2-8℃，反应时间为3-5h；

11、(b)将步骤(a)得到的a液加入至bsa溶液中，2-8℃反应过夜，制得叶酸-bsa偶联物，即叶酸完全抗原；

12、(2)将步骤(1)制备得到的叶酸-bsa作为免疫原，免疫注射绵羊，采集绵羊全血分离制备绵羊多抗。

13、作为优选，所述制备叶酸完全抗原的方法，所述步骤(a)使叶酸半抗原与n-（3-二甲基氨基丙基）-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、n-hydroxysuccinimide（nhs)活化反应，得反应物a液，活化反应温度为2-8℃，反应时间为4h。

14、更优选地，检测叶酸的荧光免疫层析检测卡包括基片；吸液部件；检测部件；和加样部件；其中，检测部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带和检测带，在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件，其中，检测带上包被有本发明的完全抗原，质控带上包被有鸡抗原igy。

15、更优选地，叶酸荧光免疫层析检测卡还包括卡盒，所述卡盒由下盖和上盖组成，上盖设有加样窗口和检测窗口，所述叶酸荧光免疫层析检测卡完全设置于下盖中，所述检测窗口和加样窗口分别对应与所述叶酸荧光免疫层析检测卡上的加样部件和质控带及检测带；在上盖上还可设有产品编号区；条形码识别区。

16、更优选地，所述基片为深色硬质基片；优选黑色pvc基片；所述检测部件为硝酸纤维素膜；所述加样部件为玻璃纤维；所述吸液部件为吸水纸。

17、更优选地，所述的一种制备叶酸完全抗原的方法，

18、还包括一种检测叶酸的检测试剂盒，其装有：

19、(a) 上述叶酸荧光免疫层析检测卡；

20、(b) 与所述叶酸荧光免疫层析检测卡配套的叶酸检测分析液；

21、(c) 利用所述叶酸检测试剂盒检测叶酸的使用说明书；

22、其中，所述检测分析液为包含有荧光标记的多克隆抗体和抗鸡igy抗体的检测分析液。

23、更优选地，根据需要自主选择荧光标记，包括alexa fluor 647、cftm647；

24、所述检测分析液的溶剂部分是含有bsa的磷酸缓冲液。

25、更优选地，所述叶酸完全抗原应用在叶酸抗体制备和免疫学检测领域。

技术特征：

1.一种叶酸完全抗原，其特征在于，所述完全抗原具有式1所示的结构：

2.根据权利要求1所述的一种叶酸完全抗原，其特征在于，所述蛋白质载体为选自下组中的任何一种蛋白质：牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)、钥孔血蓝蛋白(klh)、人血清白蛋白(hsa)及人工合成的多聚赖氨酸(pll)。

3.一种制备权利要求1所述叶酸完全抗原的方法，其特征在于所述方法包括步骤：

4.根据权利要求3所述的一种制备叶酸完全抗原的方法，其特征在于：

5.根据权利要求4所述的一种制备叶酸完全抗原的方法，其特征在于：

6.根据权利要求5所述的一种制备叶酸完全抗原的方法，其特征在于：

7.根据权利要求6所述的一种制备叶酸完全抗原的方法，其特征在于：

8.根据权利要求7所述的一种制备叶酸完全抗原的方法，其特征在于：

9.一种利用权利要求1所述叶酸完全抗原制备多克隆抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：

10.一种权利要求1所述叶酸完全抗原的应用，其特征在于：所述叶酸完全抗原应用在叶酸抗体制备和免疫学检测领域。

技术总结
本发明公开了叶酸完全抗原及其在叶酸绵羊多抗制备和免疫法检测中的应用。所述叶酸完全抗原的结构如式1所示。本发明还公开了用该完全抗原制备的抗叶酸多克隆抗体，用于检测叶酸的检测卡和检测试剂盒。本发明公开了检测叶酸的ELISA法和荧光免疫层析法，其中荧光免疫层析法操作简单、检测时间短、成本低、特异性高、重复性好。

技术研发人员：李忠鹏,何扬锦,陈颖,费晓旭
受保护的技术使用者：浙江准策生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12