一种恒温快速检测大肠杆菌的引物组合物、试剂盒及应用

本发明属于生物，具体涉及一种恒温快速检测大肠杆菌的引物组合物、试剂盒及应用。

背景技术：

1、大肠杆菌(escherichia coli)，又叫大肠埃希氏菌，escherich在1885年发现的。大肠杆菌是条件致病菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染。由于大肠杆菌容易通过食品进行传染，食品中的大肠杆菌进行快速准确的检测已成为了人们经常关注的问题。在缺乏有效治疗手段的背景下，建立起简便，灵敏，快速和准确的大肠杆菌检测方法，及时清理感染源，切断感染途径。能够有效阻止大肠杆菌病害的流行。

2、目前大肠杆菌的检测手段主要包括发酵法，滤膜法，平板计数法，免疫磁珠法以及pcr技术等分子生物学检测等方法。然而上述方法存在操作复杂、效率低、成本高，步骤繁琐等明显的局限性。因此建立起简便，准确，快速的可视化检测方法是未来大肠杆菌检测领域的研究方向。目前，rpa技术因其简便的操作、超强的特异性及灵敏度已被应用在多种核酸病毒的检测中来。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的pcr技术被局限在实验室的使用范围内，从而限制了它在资源匮乏的环境中的应用的技术问题，提供一种恒温快速检测大肠杆菌的引物组合物、试剂盒及应用。

2、本发明的引物组合物构建的试剂盒，运用于对环境样品的检测，能够快速确定环境中中是否含有大肠杆菌。

3、为了实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、一种恒温快速检测大肠杆菌的引物探针组合物，包括rpa引物对和荧光探针；所述rpa引物对的序列如下：

5、正向引物rpa-f：5'-cggtaatacggagggtgcaagcgttaatcgg-3'；

6、反向引物rpa-r：5'-cgtttacggcgtggactaccagggtatctaa-3'；

7、所述荧光探针的序列如下：5'-gaggggggtagaattccaggtgtagcgg(fam-dt)gaaa(bhq1-dt)gcgtagagat ctggagga-c3-spacer-3'。

8、上述的荧光探针序列中第28位g为fam-dt修饰碱基；第32位a为bhq1-dt修饰碱基，序列中3'末端碱基a带有c3-spacer修饰。

9、本发明的另一个目的是提供上述的引物探针组合物在制备恒温快速检测大肠杆菌的试剂盒中的应用。

10、本发明的又一个目的是提供一种恒温快速检测大肠杆菌的试剂盒，所述的试剂盒包含上述的引物探针组合物。

11、优选的，所述的试剂盒还包含荧光基础缓冲液、乙酸镁和超纯水。

12、本发明的又一个目的是提供上述的试剂盒在恒温快速检测大肠杆菌中的应用。

13、优选的，所述的应用是在恒温快速检测环境样品中是否含有大肠杆菌中的应用。

14、本发明的又一个目的是提供一种恒温快速检测大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

15、a.提取待检测样品的dna；

16、b.以步骤a的dna为模板，利用权利要求1所述的引物探针组合物进行实时荧光重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；

17、c.若扩增产物出现229bp的目的片段，则该待检测样品含有大肠杆菌；若扩增产物没有出现229bp的目的片段，则该待检测样品不含有大肠杆菌。

18、优选的，所述实时荧光重组酶聚合酶扩增的反应体系为：10μm正向引物2.1μl，10μm反向引物2.1μl，10μm探针0.6μl，荧光基础缓冲液29.5μl，超纯水11.2μl，dna模板2μl和乙酸镁2.5μl，共50μl。

19、优选的，所述实时荧光重组酶聚合酶扩增的反应条件为：39℃下反应30min。

20、本发明具有以下有益效果：

21、1、本试剂盒建立的real-time rpa(实时荧光重组酶聚合酶扩增)技术只需在39℃下30min之内就能得到检测结果，检测设备小巧且易于携带，为现场以及资源匮乏的地方提供更加方便的检测手段。

22、2、该试剂盒的检测灵敏度是qpcr的10倍，同时反应速度比qpcr更迅速。

技术特征：

1.一种恒温快速检测大肠杆菌的引物探针组合物，其特征在于，包括rpa引物对和荧光探针；所述rpa引物对的序列如下：

2.权利要求1所述的引物探针组合物在制备恒温快速检测大肠杆菌的试剂盒中的应用。

3.一种恒温快速检测大肠杆菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的引物探针组合物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含荧光基础缓冲液、乙酸镁和超纯水。

5.权利要求1所述的引物探针组合物或权利要求3所述的试剂盒在恒温快速检测大肠杆菌中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是在恒温快速检测环境样品中是否含有大肠杆菌中的应用。

7.一种恒温快速检测大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光重组酶聚合酶扩增的反应体系为：10μm正向引物2.1μl，10μm反向引物2.1μl，10μm探针0.6μl，荧光基础缓冲液29.5μl，超纯水11.2μl，dna模板2μl和乙酸镁2.5μl，共50μl。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光重组酶聚合酶扩增的反应条件为：39℃下反应30min。

技术总结
本发明公开了一种恒温快速检测大肠杆菌的引物组合物、试剂盒及应用。采用本发明的引物探针组合物对待测样品进行实时荧光重组酶聚合酶扩增，只需在39℃下30min之内就能得到检测结果，检测设备小巧且易于携带，为现场以及资源匮乏的地方提供更加方便的检测手段。并且本发明试剂盒的检测灵敏度是qPCR的10倍，同时反应速度比qPCR更迅速。

技术研发人员：李洁,张健,吕元蛟,陈煜
受保护的技术使用者：中国科学院南海海洋研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13