一种基于等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的引物组、检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种基于等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的引物组、检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟(africanswinefever，eastafricanswinefever,asf)，是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100％，病猪临床表现为发热、皮肤发绀，淋巴结、肾和胃肠粘膜明显出血。非洲猪瘟病毒(asfv)，一种巨大、复杂而古老的dna病毒。大约100年前，它在非洲肯尼亚被首次确定。

2、非洲猪瘟病毒病是猪的一种接触性病毒病，本病攻击巨噬单核细胞，典型特征是死亡率高、皮肤有变红的区域和内脏器官有严重的出血，在首次发生该病的国家和地区，死亡率可高达100％。在自然条件下，非洲猪瘟病毒寄存在钝缘蜱和隐性感染的非洲野猪、疣猪、南非野猪和大野猪中。国际兽医局将该病确定为a类动物传染病。应按照oie的有关要求，采用先进技术对非洲猪瘟进行检疫。但是，目前我国尚未进行过该病检疫技术的研究和技术储备，因此，研究建立非洲猪瘟的安全、快速检测技术和配套的检测试剂，为防止重大动物疫病传入我国作好技术储备。

3、目前，国外对非洲猪瘟诊断方法有红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验、动物接种试验、elisa、聚合酶链反应(pcr)等。其中红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验的敏感性不高且特异性不强，动物接种试验不安全。聚合酶链反应检测非洲猪瘟病毒的方法具有特异、敏感、快速的特点，但有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等特点。

4、非洲猪瘟病毒采用pcr方法检测较为常见，但较少采用等温扩增法进行检测。等温扩增技术用于代替pcr扩增技术，操作方便，节约时间成本，可以对样本进行现场快速诊断。结果判定简单，无需电泳，可直接用肉眼观察扩增产物中燃料颜色变化来判定结果；接触到的临床样本、质控、实验废弃物等材料应当作为潜在传染物进行处理，并且采用符合法规的预防措施对其处理。然而目前缺乏有效的特异性引物，阻碍了采用等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的应用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的引物组，具有特异性强、检测灵敏度高的特点。

2、本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及其应用，检测速度快、重复性好、可直接判读结果。

3、本发明提供了一种基于等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的引物，包括以下一对或几对引物对：as9-f3/as9-b3、as9-fip/as9-bip和as9-lf/as9-lb；

4、所述as9-f3的核苷酸序列如seq id no:1所示；

5、所述as9-b3的核苷酸序列如seq id no:2所示；

6、所述as9-fip的核苷酸序列如seq id no:3所示；

7、所述as9-bip的核苷酸序列如seq id no:4所示；

8、所述as9-lf的核苷酸序列如seq id no:5所示；

9、所述as9-lb的核苷酸序列如seq id no:6所示。

10、本发明提供了一种基于等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括所述引物。

11、优选的，还包括反应液。

12、本发明提供了所述引物在制备检测非洲猪瘟病毒的试剂盒中的应用。

13、本发明提供了一种非诊断目的的检测非洲猪瘟病毒的方法，包括以下步骤：

14、提取样品的dna，以提取的dna为模板，采用所述引物进行等温扩增，将扩增产物进行分析，根据扩增体系的颜色或有无目标条带判断非洲猪瘟病毒的有无。

15、优选的，所述等温扩增的反应程序在65℃下扩增50min。

16、优选的，所述等温扩增的反应体系如下：asfv9#反应液8μl、通用反应液10μl和dna2μl。

17、本发明提供了基于等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的引物，所述引物能够准确检测非洲猪瘟病毒，而对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒以及猪沙门氏菌等不能检测到，说明所述引物具有较强的非洲猪瘟病毒的检测特异性；所述引物具有较高的检测灵敏度；所述引物具有较好的重复性。

18、本发明提供了一种基于等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及其检测方法，与现有技术相比具备以下优点：

19、(1)检测时间短：等温反应只需50分钟，即可扩增满足要求的产物数量。本发明从核酸扩增到结果判定可在60分钟内完成。

20、(2)仪器简单：扩增反应只需要一台小型等温基因扩增仪就能完成，扩增反应条件温和、安全、不易污染。

21、(3)适于现场检测：本发明扩增使用小型等温扩增仪简单小巧便于使用，定性颜色判定简单快捷，参考比较基准即可判定结果。

22、综上，本发明提供的等温快速检测试剂盒及其检测方法具有时间短、仪器简单、灵敏度高、使用范围广、适于现场检测等优点，无需复杂仪器，为临床快速诊断大批量临床样本初步筛查提供技术支持，具有广阔的市场前景和显著的社会、经济效益。

技术特征：

1.一种基于等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的引物，其特征在于，包括以下一对或几对引物对：as9-f3/as9-b3、as9-fip/as9-bip和as9-lf/as9-lb；

2.一种基于等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，还包括反应液。

4.权利要求1所述引物在制备检测非洲猪瘟病毒的试剂盒中的应用。

5.一种非诊断目的的检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述等温扩增的反应程序在65℃下扩增50min。

7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，所述等温扩增的反应体系如下：asfv9#反应液8μl、通用反应液10μl和dna2μl。

技术总结
本发明提供了一种基于等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的引物组、检测试剂盒及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了基于等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的引物，对非洲猪瘟病毒具有较强的检测特异性，同时也具有较高的检测灵敏度和较好的重复性。将所述引物制备检测试剂盒，从而对非洲猪瘟病毒进行检测，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、重复性好、适用性广、可直接判读结果等多种优势。

技术研发人员：刘佳铤,潜奕青,武小琰,余飞
受保护的技术使用者：杭州百裕生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14