一种非促分裂FGF4改构体及改构体蛋白的制备方法和其在制备免疫性肝损伤药物中的应用

本发明涉及蛋白质，特别是指一种非促分裂fgf4改构体及改构体蛋白的制备方法和其在制备免疫性肝损伤药物中的应用。

背景技术：

1、由病毒、酒精、药物、化学物质或免疫失调等多种因素引起的免疫性肝损伤(immune-mediated liver injury,ili)，可导致患者肝衰竭甚至死亡，是一个全球性的健康问题。在细胞水平上，ili的特征是免疫紊乱相关的免疫细胞浸润、进行性肝坏死性炎症、肝细胞死亡和组织结构破坏。现有的免疫抑制治疗，虽然能在一定程度改善部分自身免疫性肝炎(aih)患者肝损伤，但副作用大、治疗时间长，且在停药后能达到长期缓解的病例极少，患者大多进一步演变为失代偿性肝硬化或肝癌；肝移植手术治疗，目前仍是终末期患者治疗的唯一选择，但费用高、风险大。近年来，全球ili的发病率急剧增加。因此，开展ili相关创新药物研究并攻克所涉及的关键科学问题具有重要的学术价值和临床意义。

2、越来越多的研究表明，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，fgf)家族在肝脏缺血再灌注损伤、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、肝纤维化等急慢性肝病中具有保护作用。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，fgf)中共有18个家族成员，被分为5个旁分泌和1个内分泌亚家族。fgf作用的发挥则是通过与细胞表面具有酪氨酸激酶活性的fgf受体(fgf receptor，fgfr)相互作用进而引起受体的二聚化并进一步激活下游级联信号来实现的。通过检索发现有少量的fgf4在免疫性肝损伤药物中的应用专利，如cn111944035b、cn104391125b，但由于fgfs自身结构不稳定，其易降解或聚集位点、促增殖(肿瘤)能力强、半衰期短等问题严重限制了后续应用的效果。为此，本团队积极致力于fgfs结构改造与效能升级，并开发出多种具有转化潜力的的fgfs衍生物。

技术实现思路

1、本发明的目的：为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种非促分裂fgf4改构体(简称为fgf4δnt)，其基本消除了野生型fgf4的促细胞分裂和增殖的能力，但是仍旧保留了fgf4抑制细胞凋亡、纠正免疫风暴、抗炎等功能，从而可以长期安全地给药。

2、本发明的一种技术方案：一种非促分裂fgf4改构体，改构体是通过截断人类fgf4(mature human fgf4,mfgf4)中n端氨基酸残基ala67-ala31得到的，非促分裂fgf4改构体(n-terminal truncated fgf4,fgf4δnt)蛋白的氨基酸序列为ala67-leu206。

3、本发明的一种技术方案：一种非促分裂fgf4改构体蛋白的制备方法，具有以下步骤：

4、(1)获得用于编码fgf4改构体的多核苷酸或其片段编码基因；

5、(2)将编码基因片段与载体连接，转化或转染后获得表达菌种；

6、(3)培养重组表达菌种并诱导其生产fgf4改构体蛋白；

7、(4)将步骤(3)表达菌种生产的fgf4改构体蛋白分离出。

8、本发明的一种技术方案：一种非促分裂fgf4改构体蛋白的制备方法，具有以下步骤：

9、(1)获得用于编码fgf4改构体的多核苷酸或其片段编码基因；

10、(2)编码基因转化或转染后获得表达菌种；

11、(3)培养重组表达菌种并诱导其生产fgf4改构体蛋白；

12、(4)将步骤(3)表达菌种生产的fgf4改构体蛋白分离出。

13、优选的，多核苷酸或其片段编码基因可以通过pcr方法、重组法或人工合成获得。

14、优选的，载体可以是表达载体或克隆载体。

15、优选的，表达载体选择标记基因。

16、优选的，标记基因为pet-15b质粒。

17、优选的，表达菌种可以是真核或原核的宿主细胞。

18、优选的，宿主细胞选择大肠杆菌bl21(de3)。

19、本发明的一种技术方案：非促分裂fgf4改构体在制备免疫性肝损伤药物中的应用。

20、本团队经过长期研究，自主研发了一种全新的fgf4改构体。无需敲除整个肝素结合位点，仅需截断成熟的人类fgf4(mfgf4)中稳定fgfr结合和二聚化所必需的n端氨基酸残基(ala67-ala31)即可获得仅能与fgfr形成较弱的二元复合物——fgf4非促分裂改构体(fgf4δnt)。本发明的改构体基本丧失了促细胞分裂和增殖的功能，同时又具有抑制细胞凋亡、抑制过度的免疫应答、抗炎等药理作用，对免疫性肝损伤具有显著疗效。所以比已经成药的野生型fgf4更具安全用药的前景。本发明的改构体基本保留fgf4的整体结构(并没有缺失整个hs结合区)，所以可以尽可能地利用现有fgf4的基因工程生产体系(包括载体、细胞和表达条件)，方便产业化。通过大量实验数据首次证明fgf4δnt能保护免疫性肝损伤。

技术特征：

1.一种非促分裂fgf4改构体，其特征在于：改构体是通过截断人类fgf4(mature humanfgf4,mfgf4)中n端氨基酸残基ala67-ala31得到的，非促分裂fgf4改构体(n-terminaltruncated fgf4,fgf4δnt)蛋白的氨基酸序列为ala67-leu206。

2.一种上述权利要求1非促分裂fgf4改构体蛋白的制备方法，其特征在于，具有以下步骤：

3.一种上述权利要求1非促分裂fgf4改构体蛋白的制备方法，其特征在于，具有以下步骤：

4.一种上述权利要求2或3非促分裂fgf4改构体蛋白的制备方法，其特征在于，多核苷酸或其片段编码基因可以通过pcr方法、重组法或人工合成获得。

5.一种上述权利要求2或3非促分裂fgf4改构体蛋白的制备方法，其特征在于，载体可以是表达载体或克隆载体。

6.一种上述权利要求5非促分裂fgf4改构体蛋白的制备方法，其特征在于，表达载体选择标记基因。

7.一种上述权利要求6非促分裂fgf4改构体蛋白的制备方法，其特征在于，标记基因为pet-15b质粒。

8.一种上述权利要求2或3非促分裂fgf4改构体蛋白的制备方法，其特征在于，表达菌种可以是真核或原核的宿主细胞。

9.一种上述权利要求8非促分裂fgf4改构体蛋白的制备方法，其特征在于，宿主细胞选择大肠杆菌bl21(de3)。

10.上述权利要求1到9的任一项非促分裂fgf4改构体在制备免疫性肝损伤药物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种非促分裂FGF4改构体及改构体蛋白的制备方法和其在制备免疫性肝损伤药物中的应用，是通过截断人类FGF4(Mature humanFGF4,mFGF4)中N端氨基酸残基Ala67‑Ala31得到的，非促分裂FGF4改构体(N‑terminalTruncatedFGF4,)蛋白的氨基酸序列为Ala67‑Leu206。从而减少了FGF4促细胞分裂和增殖副作用，但是具有改善免疫、抗炎、抗凋亡等活性。

技术研发人员：陈永平,潘彤彤,徐亮,陈达之,苏立晃
受保护的技术使用者：温州医科大学附属第一医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13