同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的引物组及应用

本发明涉及鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体，更具体地说是涉及同时检测和鉴别鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的引物组及应用。

背景技术：

1、家禽业是我国畜牧业的支柱产业之一，连续多年保持家禽饲养量、禽蛋产量世界第一、禽肉产量世界第二的水平。近年来，随着我国家禽产业规模化、集约化、智能化的迅猛发展，家禽支原体的感染率和发病率呈上升趋势。

2、禽类致病性的支原体主要有鸡毒支原体(mycoplasma gallisepticum,mg)和鸡滑液囊支原体(mycoplasma synoviae,ms)。mg又称鸡败血性支原体，是引起鸡呼吸系统疾病的主要病原菌。ms可引起鸡和火鸡的系统性感染发生呼吸道疾病，严重者导致关节渗出性滑液囊膜和腱鞘滑膜炎。鸡只感染mg和ms后，除造成上述症状外，还可造成鸡只生长缓慢、产蛋率下降，免疫力降低，对其它病原的易感性增加等，严重威胁养鸡业健康发展。目前，mg和ms在我国养鸡业中流行广泛且多为混合感染，二者前期引起鸡和火鸡的症状相似，为临床早期鉴别带来巨大困难。同时，鸡群中支原体隐性感染非常普遍，平时不表现明显的临床症状，往往在遇到生产应激以后诱发疾病，造成损失。因此，亟需开发新型、快速、准确的方法对mg和ms进行精准鉴别，通过流行病学调查和早期监测预警，实现疫病防控“关口前移”，为提前采取针对性的预防措施提供科学依据，降低鸡和火鸡的支原体病感染率和发病率，保障家禽行业绿色健康发展。

3、目前，实验室支原体检测方法包括培养法、pcr、血清学等检测mg和ms。但培养法耗时长、成本高、操作繁琐，血清学方法无法鉴别疫苗抗体和野毒感染产生的抗体，难以满足实际生产的需要。pcr方法具有灵敏性好、准确度高、检测速度快等特点，已经被广泛应用于动物疫病病原的检测。和常规pcr方法相比，荧光定量pcr技术，耗时更短、敏感性更高、特异性强，且可实现病原核酸的定量检测，可应用于动物疾病的流行病学调查、养殖场疫病监测预警和实验室研究等，具有良好的应用前景。同时，以上方法通常只能检测某一种支原体，工作效率低，成本高。因此，开发一种能同时检测并鉴别mg和ms荧光定量pcr方法，对于开展家禽支原体病的流行病学调查、疫病监测预警和开展针对性的防控，保障我国家禽安全生产和推进兽药减量化使用具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的引物组及应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的引物组，包括seq id no.1～seqid no.6所示的序列；

4、鸡毒支原体引物序列包括：

5、mg-f：5’-accttacctagacttgacat-3’，seq id no.1；

6、mg-r：5’-aacatctcacgacacga-3’，seq id no.2；

7、mg-probe：5’-gacaggtggtgcatggtt-3’，seq id no.3；5’端和3’端分别携带有hex和bhq1荧光基团；

8、鸡滑液囊支原体引物序列包括：

9、ms-f：5’-cacaatgggcgaaagcctgatggag-3’，seq id no.4；

10、ms-r：5’-catagttagccgttgctttctgaca-3’，seq id no.5；

11、ms-probe：5’-ttcgggttgtaaactactgtta-3’(bhq2)，seq id no.6；5’端和3’端分别携带有cy5和bhq2荧光基团。

12、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所示的引物组在制备同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体试剂盒中的应用。

13、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的试剂盒，包括所示的引物组。

14、优选地，其特征在于，包括：pcr缓冲液、对照a液和对照b液；所述pcr缓冲液包括2×premix ex taq和引物组，引物和探针浓度均为10.0μmol/l；所述对照a液为mg+ms模板，摩尔比为1:1；所述对照b液为灭菌超纯水。

15、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种以非诊断治疗为目的的同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的方法，提取检测样本的全基因组dna，以权利要求1所述的引物和探针进行荧光定量pcr反应，收集荧光信号，统计ct值，当ct值大于36时判定为阴性。

16、优选地，所述pcr反应的反应体系为：

17、

18、优选地，pcr反应程序为：

19、

20、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明达到的技术效果是：

21、(1)分别针对mg和ms的16s rrna基因核苷酸序列设计引物对和taqman探针，反应体系中各组分之间互不干扰，能够同时检测和鉴别mg和ms；

22、(2)本发明方法检测全程用时55分钟，与常规pcr(pcr扩增1小时30分钟，制备琼脂糖凝胶30分钟，电泳40分钟，观察结果10分钟)相比，具有时效快、操作简便、准确度高等特点。

23、(3)本发明的试剂盒能同时、快速、准确的鉴别mg和ms，检测最低限分别为5.4×101copies·μl-1和6.6×101copies·μl-1。

技术特征：

1.一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的引物组，其特征在于，包括seq idno.1～seq id no.6所示的序列；

2.权利要求1所示的引物组在制备同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体试剂盒中的应用。

3.一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所示的引物组。

4.根据权利要求3所述的一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的试剂盒，其特征在于，包括：pcr缓冲液、对照a液和对照b液；所述pcr缓冲液包括2×premixextaq和引物组，引物和探针浓度均为10.0μmol/l；所述对照a液为mg+ms模板，摩尔比为1:1；所述对照b液为灭菌超纯水。

5.一种以非诊断治疗为目的的同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的方法，其特征在于，提取检测样本的全基因组dna，以权利要求1所述的引物和探针进行荧光定量pcr反应，收集荧光信号，统计ct值，当ct值大于36时判定为阴性。

6.根据权利要求5所述的一种以非诊断治疗为目的的同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的方法，其特征在于，所述pcr反应的反应体系为：

7.根据权利要求6所述的一种以非诊断治疗为目的的同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的方法，其特征在于，pcr反应程序为：

技术总结
本发明公开了一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的引物组和应用，属于鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体检测技术领域，包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的序列，将该序列应用于以上2种病原的检测，具有操作简便、检测效率高、灵敏度高和准确率高等特点，可广泛应用于相关疾病流行病学调查、相关药物和疫苗实验动物和靶动物模型临床应用效果评价等研究中鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的检测和鉴别，检测结果可靠。

技术研发人员：董志民,鄢明华,王利丽,田向学,张莉,李秀丽,朱琪,池晶晶
受保护的技术使用者：天津市农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13