一种基于多酶级联催化γ-丁内酯合成1,4-丁二醇的方法

本发明涉及一种基于多酶级联催化γ-丁内酯合成1,4-丁二醇的方法,属于生物催化和生物化工。

背景技术：

1、1,4-丁二醇(1,4-butanediol，1,4-bdo)是一种大宗商品化学品，主要可用于一些重要的有机化工和精细化工(如聚对苯二甲酸丁二醇酯工程塑料、聚对苯二甲酸丁二醇酯纤维和四氢呋喃)的生产。此外，1,4-丁二醇还可用作一些反应中的溶剂和增湿剂。不仅如此，1,4-丁二醇的衍生物更可用于制造一系列具有高附加值价值的重要化合物，包括聚酯、聚氨酯、氨纶、医药品、化妆品、聚丁二酸丁二醇酯和可以生物降解的塑料等等。因此，1,4-丁二醇有着广泛的应用用途，被列入nicnas高价值量工业化学品清单(hvicl),拥有着广阔的发展前景。

2、目前，全球范围内1,4-丁二醇在工业上的生产方法主要为化学合成法，包括丁二烯法、炔醛法(reppe法)、环氧丙烷法和顺酐法。其中，顺酐法由于其原料来源广，工艺不复杂，投资较低，成本优势大等特点，逐渐成为目前主流的化学生产法。但是这些传统的制造路线依赖于不可持续再生的化石资源(乙炔或正丁烷)和能源密集型的化学工艺，这就导致了化石能源稀缺以及环境污染等问题的出现。因此，探索1,4-丁二醇合成的完整生化途径，通过引入能够将内源性前体物质或外源廉价的可再生原料转化为所需产品的人工代谢途径，实现高效、可持续的1,4-丁二醇生物合成过程是21世纪一个重要的挑战。

3、当前生物基合成1,4-丁二醇的研究主要集中在使用葡萄糖、木质纤维素等生物质经过发酵法进行合成，不但要经过漫长的代谢路径，而且代谢调控十分复杂，摩尔转化率不高。而通过生物催化的方法生产1,4-丁二醇，不仅反应温和，而且具备较好的反应选择性，可以减少金属催化剂和化石能源的消耗，提高循环经济水平，实现低碳生产。因此，开发以γ-丁内酯(gbl)为底物的酶法生产1,4-丁二醇的生物制造工业对于环境保护及提高经济循环水平都具有重大意义。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种以γ-丁内酯为底物在温和条件下转化生产1,4-丁二醇的新方法。

2、本发明提供了一种多酶级联催化γ-丁内酯生产1,4-丁二醇的方法，所述方法以己内酯水解酶(chnc)、羧酸还原酶(car)、醇脱氢酶(yqhd)和辅酶再生用酶为催化剂，共催化生产1,4-丁二醇。

3、在一种实施方式中，所述辅酶再生用酶包括但不限于甲酸脱氢酶(fdh)。

4、在一种实施方式中，所述方法首先利用己内酯水解酶将γ-丁内酯水解为4-羟基丁酸(ghb)，然后4-羟基丁酸在羧酸还原酶的作用下被还原成4-羟基丁醛(4hb)，随后，4-羟基丁醛最终被醇脱氢酶还原生成1,4-丁二醇。同时通过引入甲酸脱氢酶构建了nadh/nad+辅酶循环再生系统，通过四种酶的级联反应实现酶法高效生产1,4-丁二醇。

5、在一种实施方式中，所述己内酯水解酶来源于红球菌(rhodococcus sp.tk6)，氨基酸序列如genbank登录号：ay486161.1所示，编码所述己内酯水解酶的基因序列如seq idno.1所示。

6、在一种实施方式中，所述羧酸还原酶来源于海洋分枝杆菌(mycobacteriummarinum)，氨基酸序列如genbank登录号：nz_cp058277.1所示，编码所述羧酸还原酶的基因序列如seq id no.2所示。

7、在一种实施方式中，所述醇脱氢酶来源于大肠杆菌(e.coli k12 mg1655)，氨基酸序列如genbank登录号：ap009048.1所示，编码所述醇脱氢酶的基因序列如seq id no.3所示。

8、在一种实施方式中，所述甲酸脱氢酶来源于博伊丁假丝酵母(candidaboidinii)，氨基酸序列如genbank登录号：aj245934.1所示，编码所述甲酸脱氢酶的基因序列如seq id no.4所示。

9、在一种实施方式中，所述己内酯水解酶、羧酸还原酶、醇脱氢酶和甲酸脱氢酶分别通过大肠杆菌生产获得。

10、在一种实施方式中，所述己内酯水解酶、羧酸还原酶、醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的编码基因分别以pet28a或petduet1为表达载体。

11、在一种实施方式中，所述基因以大肠杆菌(e.coli bl21)为表达宿主，在重组大肠杆菌中成功表达的。

12、在一种实施方式中，所述酶液是通过将上述重组大肠杆菌菌株用lb培养基活化后于37℃、160-180r/min的条件下培养10-12h，得到种子液；将种子液以1％的接种量转接入50ml的lb液体培养基中，继续培养2h至od600为0.8，得到发酵液；发酵液在加入0.5mmol/l终浓度的iptg后于16℃诱导12-14h。发酵完毕之后，在4℃，8000r/min的条件下离心10min收集菌体；将菌体用ph 7.4的磷酸盐缓冲液清洗两次后彻底洗去培养基；最后将菌悬液置于细胞破碎仪中破碎，待破碎完毕之后，4℃、12000r/min条件下离心20min获得的。

13、在一种实施方式中，所述方法是在含辅酶nadh和用于辅酶循环再生的甲酸钠的反应体系中进行催化反应。

14、在一种实施方式中，所述转化是在30～35℃、ph 7.0～8.0条件下进行的。

15、在一种实施方式中，转化反应体系中底物γ-丁内酯的浓度为5～10g/l。

16、在一种实施方式中，所述己内酯水解酶、羧酸还原酶、醇脱氢酶的酶活之比为1:3:2。

17、在一种实施方式中，反应过程中还进行1～2次补料；所述补料是补加终浓度5g/l底物γ-丁内酯和等摩尔比(0.12m)的共底物甲酸钠。

18、在一种实施方式中，所述反应体系中含有5g/l(0.06m)的底物γ-丁内酯、24mmnadh、0.12m甲酸钠、终浓度1u/l的甲酸脱氢酶，酶活力之比1:3:2的己内酯水解酶、羧酸还原酶、醇脱氢酶；所述己内酯水解酶添加量为10u/l。

19、本发明提供了己内酯水解酶、羧酸还原酶、醇脱氢酶和甲酸脱氢酶或含上述四种酶的酶制剂在制备1,4-丁二醇方面的应用。

20、有益效果：

21、(1)本发明的己内酯水解酶(chnc)、羧酸还原酶(car)、醇脱氢酶(yqhd)以及甲酸脱氢酶(fdh)，可通过多酶级联法催化γ-丁内酯在温和条件下转化生产1,4-丁二醇；

22、(2)利用本发明的方法制备1,4-丁二醇，该反应时间较直接发酵更短，且中间操作较少，摩尔转化率更高，同时相比于利用金属催化剂催化，反应成本大大降低，具有重要的价值和意义。

技术特征：

1.一种多酶级联催化γ-丁内酯生产1,4-丁二醇的方法，其特征在于，所述方法以己内酯水解酶、羧酸还原酶、醇脱氢酶和辅酶再生用酶为催化剂，共催化生产1,4-丁二醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述己内酯水解酶的氨基酸序列如genbank登录号：ay486161.1所示；所述羧酸还原酶的氨基酸序列如genbank登录号：nz_cp058277.1所示；所述醇脱氢酶的氨基酸序列如genbank登录号：ap009048.1所示；所述辅酶再生用酶包括但不限于甲酸脱氢酶；所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如genbank登录号：aj245934.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述己内酯水解酶、羧酸还原酶、醇脱氢酶和甲酸脱氢酶是由大肠杆菌发酵制得。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，己内酯水解酶、羧酸还原酶、醇脱氢酶和甲酸脱氢酶分别以pet28a或petduet1为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主，发酵获得。

5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述方法是在含辅酶nadh和用于辅酶循环再生的甲酸钠的反应体系中进行催化反应。

6.根据权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，方法是在30～35℃、ph 7.0～8.0条件下进行的。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，转化反应体系中底物γ-丁内酯的浓度为5～10g/l。

8.根据权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于，所述己内酯水解酶、羧酸还原酶、醇脱氢酶的酶活之比优选1:3:2。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，反应过程中还进行补料；所述补料是补加γ-丁内酯和等摩尔比的共底物甲酸钠。

10.权利要求1～9任一所述方法在制备含1,4-丁二醇的产品方面的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于多酶级联催化γ‑丁内酯合成1,4‑丁二醇的方法，属于生物催化和生物化工技术领域。本发明提供了利用己内酯水解酶、羧酸还原酶、醇脱氢酶以及辅酶再生用酶多酶级联法催化γ‑丁内酯的方法，能够在温和条件下转化生产1,4‑丁二醇，反应时间较直接发酵更短，且中间操作较少，摩尔转化率更高，同时相比于利用金属催化剂催化，反应成本大大降低，具有重要应用价值。

技术研发人员：杨套伟,饶志明,郭艺鸣,姜君逸,张显,徐美娟
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13