METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法与流程

本发明涉及mettl5，尤其涉及mettl5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法。

背景技术：

1、2021年统计数据显示，肺癌位居全球癌症相关死亡之首，每年因肺癌死亡人数达180万。我国每年肺癌新发及死亡患者分别占全球37％及39.8％。肺癌主要分非小细胞肺癌(nsclc)和小细胞肺癌两种类型，其中非小细胞肺癌占总数的85％左右，肺腺癌又是其中最常见类型。除常规的放疗、化疗以及手术治疗等手段外，近年来随着靶向及免疫治疗的长足发展，使肺腺癌患者生存有了明显改善，但患者五年总生存仍不足20％。因此探究肺癌发病机制，寻找新的治疗靶点，是目前研究的临床科学问题之一。据报道，近来作为研究热点的m6a转录后修饰在肿瘤发生发展中发挥重要作用。本研究探讨了m6a相关修饰酶mettl5在肺腺癌中的可能作用，揭示了mettl5可能通过调控上皮间质转化(emt)相关分子促进肺腺癌细胞系a549、h1975细胞迁移、侵袭。

2、m6a rna甲基化修饰属于表观转录组学范畴，指通过rna修饰与编辑介导基因转录后水平调控，近年来受到广泛关注。研究发现，m6a修饰在各种rna中均丰富而保守，表明其广泛调控基因表达。m6a修饰通过对癌基因表达的调节，调控肿瘤的发生与进展。li等分析tcga数据库及临床肿瘤组织，研究发现mettl3的高水平与结直肠癌患者较短的总生存期及无进展生存期显著相关。liu等研究表明以m6a依赖的方式增强eif3c的翻译，并同时促进整体翻译输出，从而促进卵巢癌的发生和转移。随着研究的深入，m6a修饰在肺腺癌进展中的机制也逐渐被揭示。yin等发现rmrp(rna component of mitochondrial rna-processingendoribonuclease)在nsclc中高表达，mettl3通过提高rmrp rna的m6a水平增强其稳定性，通过调节tgfbr1/smad2/smad3途径使nsclc进展。目前mettl5在nsclc中的作用机制尚未见报道。因此，本研究拟通过体外细胞学实验探究mettl5对nsclc细胞增殖和迁移的影响及作用机制，为nsclc的治疗提供潜在的有效分子靶点。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供mettl5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法，以解决上述技术问题。

2、为实现上述目的本发明采用以下技术方案：

3、mettl5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法，包括以下步骤：

4、步骤1、细胞培养、转染及稳转株筛选；

5、a549细胞及h1975细胞使用rpmi-1640完全培养基培养，当细胞汇合度达到90％左右并处于对数生长期时，消化并重悬a549细胞及h1975细胞接种于6孔板中，分别使用nc及mettl5的干扰慢病毒按说明书进行转染，分为nc及shmettl5组，72h后通过荧光显微镜观察荧光，重新铺板，加入5ug/ml嘌呤霉素，筛选mettl5敲低的稳转株；

6、步骤2、临床数据分析

7、首先在基因表达数据集(geo)中搜索肺腺癌数据，下载数据集，分析mettl5表达情况，利用gepia根据mettl5的表达差异对肺腺癌患者进行生存分析，绘制kaplan-meier生存曲线；

8、步骤3、western blot法检测；

9、取经嘌呤霉素筛选后、镜下可见荧光的两组细胞，使用蛋白裂解液2×loadingbuffer裂解细胞提取蛋白，并在95℃条件下金属浴10min使蛋白边变性，吸取8μl样品加入上样孔中，使用140v电泳60min，200ma转膜90min，5％脱脂牛奶进行封闭，1h后tbst清洗pvdf膜3次，将pvdf膜与一抗室温孵育2h，tbst将pvdf膜清洗3次后放于hrp标记的anti-rabbit igg二抗1:2000中孵育1h，tbst清洗后使用超敏发光液进行显影；

10、步骤4、transwelltm实验检测；

11、检测迁移能力时，将处于对数生长期的nc组、shmettl5组a549和h1975细胞消化并离心重悬，计数并将细胞浓度调节至1×105/ml，向上室中每孔加入200ul细胞悬液，并在下室中加入800ul的1640完全培养基，培养24h，弃上层液体，pbs清洗两次，用棉签拭去上室内的细胞，将小室置于固定液中固定20min，弃去固定液，清洗后将小室置于0.1％结晶紫染液中染色15min，再次清洗并晾干，放于显微镜下拍照计数，检测侵袭能力时，先将matrigel基质胶与1640培养基1:20均匀混合后，向上室内每孔加入100ul混合液，置于培养箱中过夜，然后加入细胞悬液；

12、步骤5、统计分析；

13、采用graph pad prism软件进行统计学分析，免疫印迹实验结果中的平均灰度值比值及transwelltm实验细胞数都以均数±标准差表示，采用one way anova，即单因素方差分析用来总体分析后，一旦确定均值间存在差值，两两范围检验和成对多重比较确定哪些均值存在显著性差异，p<0.05作为差异有统计学意义。

14、作为本发明进一步的方案，步骤1中rpmi-1640完全培养基培养，含10％fbs、1％青链霉素双抗，培养箱条件为37℃、5％co2。

15、作为本发明进一步的方案，步骤3中一抗为anti-human mettl5多克隆抗体1:1000、anti-human gapdh单克隆抗体1:2000。

16、作为本发明进一步的方案，步骤4中完全培养基为20％fbs。

17、作为本发明进一步的方案，步骤4中固定液为4％多聚甲醛溶液。

18、作为本发明进一步的方案，步骤4中并在下室中加入800ul的1640完全培养基，培养24h，培养条件为：37℃、5％浓度的co2。

19、与现有技术相比，本发明具有以下优点：通过该实验方法发现敲低mettl5能够显著抑制肺腺癌细胞的emt，从而抑制肺腺癌细胞的迁移、侵袭能力，表明mettl5通过促进肺腺癌细胞emt进程进而促进肺腺癌进展。mettl5在肺腺癌中高表达，其表达水平与患者预后呈明显负相关，并且mettl5通过促进肺腺癌细胞emt进程促进肺腺癌迁移、侵袭。mettl5可能在肺腺癌进展中发挥重要作用。因此，靶向mettl5有望成为治疗肺腺癌的潜在靶点。

技术特征：

1.mettl5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于，步骤1中rpmi-1640完全培养基培养，含10％fbs、1％青链霉素双抗，培养箱条件为37℃、5％co2。

3.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于，步骤3中一抗为anti-human mettl5多克隆抗体1:1000、anti-human gapdh单克隆抗体1:2000。

4.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于，步骤4中完全培养基为20％fbs。

5.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于，步骤4中固定液为4％多聚甲醛溶液。

6.如权利要求1所述的实验方法，其特征在于，步骤4中并在下室中加入800ul的1640完全培养基，培养24h，培养条件为：37℃、5％浓度的co2。

技术总结
本发明公开METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法。采用公共基因表达数据集数据库，分析肺腺癌及癌旁组织METTL5的表达，Westernblot检测正常肺上皮BEAS‑2B和肺腺癌A549、H1975细胞系中METTL5蛋白表达水平。应用LV3‑METTL5‑shRNA慢病毒感染肺腺癌A549和H1975细胞系以敲低两种细胞系中METTL5基因表达，并通过Transwell<supgt;TM</supgt;法检测敲低METTL5基因后，上述两种细胞系迁移、侵袭能力。METTL5能通过促进EMT过程促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭。METTL5可能在肺腺癌进展中发挥重要作用。因此，靶向METTL5有望成为治疗肺腺癌的潜在靶点。

技术研发人员：王晔,王蕊红,徐峰,任继风,王婷婷
受保护的技术使用者：青岛市中心医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13