一种基于LAMP-LFD检测泰泽病原体的引物组合、试剂盒及方法

本发明属于医学分子生物学检测，尤其涉及一种基于lamp-lfd检测泰泽病原体的引物组合、试剂盒及方法。

背景技术：

1、泰泽病原体是一种携带鞭毛、菌毛、芽胞，寄生宿主细胞内的毛发样梭状芽胞杆菌，广泛存在于啮齿类动物、家禽、家畜及非人灵长类，能够引起动物肠道组织出血性坏死和肝脏多发性粟粒状坏死。当外界环境改变或免疫抑制时可诱导泰泽病原体感染的动物突然发病致使肿瘤移植实验中断，因此被称为“毁灭致癌研究的头号疾病”，故各国都将其列为实验动物必须排除的病原菌，是在实验动物质量控制中作为清洁级实验动物必须排除的病原菌之一。而实验室对泰泽病原体的诊断主要依靠病理学检查、免疫荧光试验(ifa)和酶联免疫吸附试验(elisa)等，我国实验动物泰泽病原体检测方法国标gb/t14926.10-2008删除可的松激发试验，仅提供血清学抗体检测方法。因此，如何建立快速、准确、方便的实验动物泰泽病原体检测方法对国民经济生物医药产业支撑尤为重要。

2、目前，已有多种检测方法即免疫学实验、反向斑点反应方法(reverse dot blot，rdb)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)、elisa等用于快速检测病原体。但上述检测方法存在操作繁琐费时、灵敏度及特异性不足和使用仪器试剂成本较高等缺点。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)技术是在一定温度和链置换bst2.0 dna聚合酶的作用下，针对目标基因上6个特定位点设计4条与之对应lamp引物，并在1h内持续进行延伸置换过程。该方法操作简单、省时、灵敏度和特异性较高、对仪器设备要求低。但是lamp的扩增产物主要通过比浊仪、电泳和钙黄绿素荧光染料等进行检测，且在电泳分析过程中需要接触致癌物eb，加入的钙黄绿素荧光染料对人体有害，这些缺点降低了lamp技术在该领域的实用性。目前，基于lamp-lfd方法对泰泽病原体进行检测的相关技术未见报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测泰泽病原体的lamp引物组合，可实现对泰泽病原体快速、准确的检测。

2、本发明的目的还在于提供一种基于lamp-lfd检测泰泽病原体的试剂盒和基于lamp-lfd检测泰泽病原体的方法，可以通过颜色变化直接判断泰泽病原体的存在。

3、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

4、本发明提供了一种检测泰泽病原体的lamp引物组合，包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip、反向内引物bip、环引物lf和探针pb1；

5、所述f3序列如seq id no：1所示，b3序列如seq id no：2所示，fip序列如seq idno：3所示，bip序列如seq id no：4所示，lf序列如seq id no：5所示，pb1序列如seq id no：6所示。

6、优选的，所述fip的5’端标记有生物素，pb1的5’端标记有荧光基团。

7、优选的，所述荧光基团包括fam或fitc。

8、本发明还提供了上述引物组合在制备检测泰泽病原体的试剂盒中的应用。

9、本发明还提供了一种基于lamp-lfd检测泰泽病原体的试剂盒，包括上述引物组合和lfd试纸条。

10、优选的，所述试剂盒中外引物：内引物：环引物：探针的浓度比为1:8:4:2。

11、优选的，所述试剂盒还包括dntps、mgso4、bst2.0 dna聚合酶、反应缓冲液和ddh2o。

12、本发明还提供了一种基于lamp-lfd检测泰泽病原体的方法，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：提取待测对象dna，建立lamp反应体系进行扩增反应，扩增产物滴至lfd试纸条进行显色反应。

13、优选的，所述lamp反应体系包括：2.5μl 10×反应缓冲液、1.25μl100mm mgso4、1.6μl 25mm dntps、1μl40μm fip、1μl40μm bip、1μl 5μm f3、1μl 5μm b3、1μl 20μm lf、1μl 10μm pb1、1μl 8u/μlbst2.0 dna聚合酶、1μl dna模板，11.65μl ddh2o。

14、优选的，所述反应温度为55～70℃，反应时间为10～60min。

15、本发明的有益效果：

16、本发明提供了检测泰泽病原体的lamp引物组合，结合lamp放大原理和横向流动试纸条(lateral flow dipstick，lfd)使用层析试纸条显示结果，建立准确、特异泰泽病原体lamp-lfd检测方法，该方法减少对精密设备依赖，依据检测线处是否出现红色条带，判断其阴性还是阳性结果，此检测方法无需添加钙黄绿素与羟基萘酚蓝染料，消除通过肉眼鉴别观察颜色变化所引起人为误差，同时减少制备琼脂糖凝胶电泳时与致癌物eb接触，避免放射物、致癌物eb和钙黄绿素等对环境污染和人员健康危害，为实验动物泰泽病原体现场快速检测提供一种可靠有效的方法，在实验动物质量安全控制方面具有良好市场应用前景。

17、本发明lamp-lfd检测泰泽病原体最低浓度达到0.1fg/μl，灵敏度高，特异性好，是pcr反应灵敏度的100倍。本发明与其他分子生物学检测方法相比，具有操作更简便、易快捷、成本低，灵敏性高、特异性强和重复性好的特点，具有重要市场应有价值和前景。

技术特征：

1.一种检测泰泽病原体的lamp引物组合，其特征在于，包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip、反向内引物bip、环引物lf和探针pb1；

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述fip的5’端标记有生物素，pb1的5’端标记有荧光基团。

3.根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，所述荧光基团包括fam或fitc。

4.权利要求1～3任意一项所述的引物组合在制备检测泰泽病原体的试剂盒中的应用。

5.一种基于lamp-lfd检测泰泽病原体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述的引物组合和lfd试纸条。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中外引物：内引物：环引物：探针的浓度比为1:8:4:2。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dntps、mgso4、bst2.0dna聚合酶、反应缓冲液和ddh2o。

8.一种基于lamp-lfd检测泰泽病原体的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于，包括以下步骤：提取待测对象dna，建立lamp反应体系进行扩增反应，扩增产物滴至lfd试纸条进行显色反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述lamp反应体系包括：2.5μl10×反应缓冲液、1.25μl100mmmgso4、1.6μl25mmdntps、1μl40μmfip、1μl40μmbip、1μl5μmf3、1μl5μmb3、1μl20μmlf、1μl10μmpb1、1μl8u/μlbst2.0dna聚合酶、1μldna模板，11.65μlddh2o。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应温度为55～70℃，反应时间为10～60min。

技术总结
本发明提供了一种基于LAMP‑LFD检测泰泽病原体的引物组合、试剂盒及方法，属于医学分子生物学检测技术领域。本发明提供的引物组合包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、环引物LF和探针PB1。本发明还提供了基于上述引物组合的检测泰泽病原体的试剂盒和方法，可实现对泰泽病原体的检测，并且检测方法简单，耗时短，结果便于判断，检测准确性和灵敏度高。

技术研发人员：戴方伟,鄢慧琼,韩伟,周莎桑,杜江涛,陶俊豪,郭红刚,应华忠
受保护的技术使用者：杭州医学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13