检测甲型H1N1流感病毒的引物探针组、试剂盒及方法与流程

本申请涉及分子检测，尤其涉及检测甲型h1n1流感病毒的引物探针组、试剂盒及方法。

背景技术：

1、甲型流感属于正粘病毒科，它包含一个由8段编码11种蛋白质的负链rna组成的基因组。甲型流感亚型分类主要基于两种主要细胞表面糖蛋白的抗原性：血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)，已鉴定出16个ha和9个na亚型。

2、新型甲型h1n1(2009)流感病毒的毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片断，是一种新型猪流感病毒(2009流行株)。甲型h1n1(2009)流感病毒可直接从猪传播至人，亦可出现人际间传播。感染病毒的猪或人是主要的感染来源，隐性感染者也具有传染性。人也可能可通过3种途径传播：接触接触(当被污染的手接触到面部膜时)、飞沫喷雾接触(当传染性飞沫投射到粘膜上时)和空气传播(通过吸入传染性空气传播颗粒)。潜伏期与季节性流感类似，估计1至7天。甲型h1n1(2009)流感病毒污染的环境也是潜在的感染来源。

3、当前，现有的检测甲型h1n1病毒的试剂盒存在假阳性高，使用外源性内标系统，扩增时间长，灵敏度低等情况。

技术实现思路

1、本申请实施例的目的在于提出一种检测甲型h1n1流感病毒的引物探针组、试剂盒及方法，本申请检测结果准确，灵敏度高。

2、为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种检测甲型h1n1流感病毒的引物探针组、试剂盒及方法，采用了如下所述的技术方案：

3、一种检测甲型h1n1流感病毒的引物探针组，所述引物探针组包括：

4、ha正向引物，其核苷酸序列如seq id no.1所示；

5、ha反向引物，其核苷酸序列如seq id no.2所示；

6、ha探针，其核苷酸序列如seq id no.3所示；

7、na正向引物，其核苷酸序列如seq id no.4所示；

8、na反向引物，其核苷酸序列如seq id no.5所示；

9、na探针，其核苷酸序列如seq id no.6所示；

10、内标正向引物，其核苷酸序列如seq id no.7所示；

11、内标反向引物，其核苷酸序列如seq id no.8所示；以及

12、内标探针，其核苷酸序列如seq id no.9所示。

13、进一步的，seq id no.1对应的5’至3’端的核苷酸序列为gggaaagaagtcctcgtyct；

14、seq id no.2对应的5’至3’端的核苷酸序列为cmggcttgaacttcttgctg；

15、seq id no.3对应的5’至3’端的核苷酸序列为tggggcattcaccatccatctactagtgct；

16、seq id no.4对应的5’至3’端的核苷酸序列为gtytgcagggataactggca；

17、seq id no.5对应的5’至3’端的核苷酸序列为tactggaccacaactgcctgtc；

18、seq id no.6对应的5’至3’端的核苷酸序列为tggctcgaatcgaccgtgggtgt；

19、seq id no.7对应的5’至3’端的核苷酸序列为aagaaggtggtgaagcaggc；

20、seq id no.8对应的5’至3’端的核苷酸序列为gagtgggtgtcgctgttgaag；

21、seq id no.9对应的5’至3’端的核苷酸序列为caagggcatcctgggctacactgagc。

22、进一步的，所述ha探针的5’端标记有fam，3’端标记有bhq1。

23、进一步的，所述na探针的5’端标记有vic，3’端标记有bhq1。

24、进一步的，所述内标探针的5’端标记有cy5，3’端标记有bhq2。

25、为了解决上述技术问题，本申请实施例还提供一种检测甲型h1n1流感病毒的试剂盒，采用了如下所述的技术方案：

26、一种检测甲型h1n1流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括pcr反应液，所述pcr反应液包括上述的引物探针组。

27、进一步的，所述pcr反应液还包括dntps、udg酶、c-mmlv酶、热启动taq抗体酶以及镁离子；

28、其中，所述dntps包括datp、dgtp、dctp、dutp。

29、进一步的，所述引物探针组中引物和探针的浓度均为0.1pmo l/μl-0.3pmo l/μl。

30、进一步的，所述dntps的浓度为10～50mmo l/l，所述udg酶的浓度为1～10u/μl，所述c-mmlv酶的浓度为100～200u/μl，所述热启动taq抗体酶的浓度为10～50u/μl，所述镁离子的浓度为0.1～2mmo l/l。

31、为了解决上述技术问题，本申请实施例还提供一种检测甲型h1n1流感病毒的方法，采用了如下所述的技术方案：

32、一种使用上述试剂盒检测甲型h1n1的方法，包括下述步骤：

33、对待测样本进行核酸提取操作，获得待测样本核酸；

34、将所述pcr反应液分装到多个pcr管中，分别加入对应的所述待测样本核酸、阴性质控品以及阳性质控品，离心；

35、置于pcr扩增仪中，进行pcr扩增操作，读取荧光，获得检测结果。

36、与现有技术相比，本申请实施例主要有以下有益效果：

37、本申请在新型甲型h1n1基因组的选择ha、na基因片段保守区，设计特异性引探，检测2个靶标，以提高检测的准确性。其中，ha、na引探与内标引探不发生交叉反应，ha、na引探与新型甲型h1n1流感病毒种属相近的及引起症状相似的其他病原体不发生交叉反应。本申请通过三种不同的荧光标记探针，实现在检测过程中，用三通路三荧光通道进行检测。同时使用内源性系统监控取样、提取、扩增等过程，避免假阴性。本申请使用rt-pcr一步法，将逆转录反应与实时荧光pcr扩增一个反应进行，以优化反应扩增程序，减少扩增时间。

技术特征：

1.一种检测甲型h1n1流感病毒的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括：

2.根据权利要求1所述的检测甲型h1n1流感病毒的引物探针组，其特征在于，seq idno.1对应的5’至3’端的核苷酸序列为gggaaagaagtcctcgtyct；

3.根据权利要求1所述的检测甲型h1n1流感病毒的引物探针组，其特征在于，所述ha探针的5’端标记有fam，3’端标记有bhq1。

4.根据权利要求1所述的检测甲型h1n1流感病毒的引物探针组，其特征在于，所述na探针的5’端标记有vic，3’端标记有bhq1。

5.根据权利要求1所述的检测甲型h1n1流感病毒的引物探针组，其特征在于，所述内标探针的5’端标记有cy5，3’端标记有bhq2。

6.一种检测甲型h1n1流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括pcr反应液，所述pcr反应液包括如权利要求1至5任一项所述的引物探针组。

7.根据权利要求6所述的检测甲型h1n1流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应液还包括dntps、udg酶、c-mmlv酶、热启动taq抗体酶以及镁离子；

8.根据权利要求6所述的检测甲型h1n1流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组中引物和探针的浓度均为0.1pmol/μl-0.3pmol/μl。

9.根据权利要求7所述的检测甲型h1n1流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述dntps的浓度为10～50mmol/l，所述udg酶的浓度为1～10u/μl，所述c-mmlv酶的浓度为100～200u/μl，所述热启动taq抗体酶的浓度为10～50u/μl，所述镁离子的浓度为0.1～2mmol/l。

10.一种使用如权利要求6至9任一项所述的试剂盒检测甲型h1n1的方法，其特征在于，包括下述步骤：

技术总结
本申请实施例属于分子检测技术领域，涉及一种检测甲型H1N1流感病毒的引物探针组、试剂盒及方法，所述引物探针组包括：HA正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；HA反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；HA探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；NA正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；NA反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；NA探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；内标正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；内标反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；以及内标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。本申请检测结果准确，灵敏度高。

技术研发人员：彭春梅,蒋析文,廖丽丽,殷剑波,董子维
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/12