一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物及其应用

本发明属于生物工程，涉及微生物检测方法，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物及其应用。

背景技术：

1、鸭疫里默氏杆菌(riemerella anatipestifer)是鸭疫里默氏杆菌感染的病原。鸭疫里默氏杆菌感染是一种高致病性、接触性的细菌性疾病，本病发生呈急性或慢性败血性过程，以心包炎、肝周炎、气囊炎、脑炎和关节炎以及干酪性输卵管炎为特征。自然条件下鸭最易感，各品种鸭均能感染发病。该病一年四季均可发生，没有明显的季节性。感染鸭群中的致病率可达90％，死亡率可达5％-80％。目前该病流行于全国各养鸭地区，给养鸭业造成了重大的经济损失。根据临床发病情况、剖检病变等鉴定鸭疫里默氏杆菌感染存在不足，不易与其他发病类似的疾病相区别，只能做出初步诊断，不利于及时诊断病因及控制病情。为了快速、准确、简便的诊断该病，必须进行实验室检测。

技术实现思路

1、本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物及其应用。

2、本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

3、本发明提供一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：

4、上游引物：5’tagcatctcttggattcccttc 3’，

5、下游引物：5’ccagtttttaaccaccattaccc 3’。

6、本发明提供一种上述特异性引物在鸭疫里默氏杆菌快速检测中的应用。

7、本发明提供一种鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒，所述试剂盒含有上述特异性引物。

8、作为本发明的进一步优化方案，所述试剂盒还含有鸭疫里默氏杆菌dna提取试剂盒、扩增反应试剂、阳性对照物。

9、本发明提供一种鸭疫里默氏杆菌检测的方法，包括如下步骤：

10、(1)提取待测样品基因组总dna；

11、(2)利用上述特异性引物，以所述总dna作为pcr模板，进行pcr扩增；

12、(3)对pcr扩增反应完成后的反应产物进行检测，检测到目标扩增对象的即为阳性样品。

13、作为本发明的进一步优化方案，所述pcr扩增的反应体系为taqdna聚合酶：0.5μl，10×pcrbuffer：5.0μl，2.5mmdntps：4.0μl，上游引物f：1.0μl，下游引物r：1.0μl，模板：4.0μl，加水补至50μl。

14、作为本发明的进一步优化方案，所述pcr扩增的反应程序为95.0℃，2min；94.0℃，30s；57℃，30s；72.0℃，40s；35次循环；72.0℃延伸10min。

15、作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(3)中对pcr扩增反应完成后的反应产物进行检测，检测方法为将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

16、作为本发明的进一步优化方案，进行琼脂糖凝胶电泳分析时，若检测到338bp单一扩增条带即表明待测样品是鸭疫里默氏杆菌，即为阳性样品，若未出现相应的338bp单一扩增条带，则说明不是鸭疫里默氏杆菌。

17、作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(1)具体为：无菌挑取病鸭的肝脏、脑组织或心血划线接种于含10％牛血清的胰酪大豆胨液体培养基中，37℃摇床振荡培养12-16h，获得待测样品基因组总dna。

18、本发明的有益效果在于：提供一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物及其应用，通过这种实验室检测方法可快速、准确诊断鸭疫里默氏杆菌感染，即能在鸭疫里默氏杆菌感染病害显症前进行检测，又可对病害的发生进行早期预警，防治病害的扩散蔓延。对于该病的诊断、预警和防治具有重要意义。

技术特征：

1.一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列为：

2.一种如权利要求1所述的特异性引物在鸭疫里默氏杆菌快速检测中的应用。

3.一种鸭疫里默氏杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的特异性引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有鸭疫里默氏杆菌dna提取试剂盒、扩增反应试剂、阳性对照物。

5.一种鸭疫里默氏杆菌检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系为taqdna聚合酶：0.5μl，10×pcrbuffer：5.0μl，2.5mmdntps：4.0μl，上游引物f：1.0μl，下游引物r：1.0μl，模板：4.0μl，加水补至50μl。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应程序为95.0℃，2min；94.0℃，30s；57℃，30s；72.0℃，40s；35次循环；72.0℃延伸10min。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中对pcr扩增反应完成后的反应产物进行检测，检测方法为将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，进行琼脂糖凝胶电泳分析时，若检测到338bp单一扩增条带即表明待测样品是鸭疫里默氏杆菌，即为阳性样品，若未出现相应的338bp单一扩增条带，则说明不是鸭疫里默氏杆菌。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：无菌挑取病鸭的肝脏、脑组织或心血划线接种于含10％牛血清的胰酪大豆胨液体培养基中，37℃摇床振荡培养12-16h，获得待测样品基因组总dna。

技术总结
本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物及其应用，属于生物工程技术领域，涉及微生物检测方法，所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物：5’TAGCATCTCTTGGATTCCCTTC3’，下游引物：5’CCAGTTTTTAACC ACCATTACCC3’；本发明提供一种鸭疫里默氏杆菌检测的特异性引物及其应用，通过这种实验室检测方法可快速、准确诊断鸭疫里默氏杆菌感染，即能在鸭疫里默氏杆菌感染病害显症前进行检测，又可对病害的发生进行早期预警，防治病害的扩散蔓延。对于该病的诊断、预警和防治具有重要意义。

技术研发人员：郝东敏,陈丽颖,魏战勇,程冰花,陈家勤,刘洪
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13