一种用于检测气单胞菌的引物组、试剂盒、方法及应用与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测气单胞菌的引物组、试剂盒、方法及应用。

背景技术：

1、气单胞菌属细菌(aeromonas)是一种常见的革兰氏阴性兼性厌氧球杆菌，广泛分布于水产养殖等水环境中。其中有些细菌如达卡气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌等是水产养殖病原菌，与水产健康养殖紧密相关。现有的一些方法如专利zl201210460319.3公开了检测水体中的气单胞菌，不过没有包含到达卡气单胞菌(aeromonas dhakensi s)的鉴定。随着养殖病害的发展，病原种类和主要的流行病原也在发生变化，已有的方法已不能满足现阶段的需要。

2、另外现有方法主要是局限于气单胞菌病原的检测，不能分析各个气单胞菌细菌在环境中多态性分布丰度。水环境中往往是包含有多菌，如目前鉴定的水体气单胞菌属细菌有30多种，常见的还包含有柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、沙门菌属、泛菌属以及不动杆菌属细菌等，气单胞菌病原细菌在环境中的多态性分布丰度与病害的发生密切相关。因此建立能从众多细菌中特异性的鉴定出气单胞菌菌属细菌，并且能够分析各气单胞菌属细菌，特别是主要病原菌在水体环境中的多态性分布丰度的方法，对监控该属病原的繁殖、流行规律、以及疾病的及时防治都具有重要的指导意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决现有技术的不足，发明人利用在鱼体分离到的达卡气单胞菌菌株202108b2(genbank no.oq283677)，嗜水气单胞菌菌株jxsks1(genbankno.kj150710.1)，维氏气单胞菌fz1n(genbank no.mf716716)、豚鼠气单胞菌xg3n-2(genbank no.mf716666)以及温和气单胞菌ytxwn(genbank no.oq283651)，对其进行了全基因组测序，通过基因组比较分析，筛选气单胞菌属细菌分子标记，寻找共有的相似性高，又存在差异的序列片段，作为分子标记序列库，根据筛选得到的分子标记序列库，设计大量的引物进行试验验证，验证特异性和灵敏度，最终获得了特异性强、灵敏度高的既可以鉴定气单胞菌菌属细菌，又可以分析气单胞菌属细菌的多态性分布丰度的分子标记和引物。具体技术方案如下：

2、一种用于检测气单胞菌的引物组，包括上游引物aer-1f和下游引物aer-1r，上游引物aer-1f的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物aer-1r的核苷酸序列如seq idno.2所示；引物组的靶标基因为气单胞菌属细菌的aer-1，aer-1的核苷酸序列如seq idno.3所示。

3、本发明所采用的上述新靶标aer-1作为遗传标记，其存在于气单胞菌中且具有一定的属种间保守性，能特异性地鉴别达卡气单胞菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌等，又可以分析气单胞菌属细菌在环境中的多态性分布丰度。根据上述新靶标aer-1设计合成了上游引物aer-1f和下游引物aer-1r，其对气单胞菌属细菌dna核酸检测灵敏度能够达到7.415×10-5ng/μl。

4、本发明基于上述新靶标aer-1和引物组的检测手段不仅能够鉴定环境中的气单胞菌，能够很好地将气单胞菌属细菌与其它菌属如不动杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、杆菌属、泛菌属鉴别区分，还能分析气单胞菌属细菌例如嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌与达卡气单胞菌等在环境中的多态性分布丰度，具有灵敏度高，特异性强的特点。

5、基于此，本发明还提供了一种用于水体中气单胞菌属多态性丰度分析的方法，包括以下步骤：提取水体样品的总dna，采用上述的引物组进行扩增，扩增产物建库，通过高通量测序与所述aer-1进行比对，从而获得所述水体样品中气单胞菌属的分布丰度。

6、此外，上述的引物组能够用于制备检测气单胞菌的产品中，例如鉴定试剂或试剂盒。本发明基于此也提供了一种检测气单胞菌的试剂盒，包括上述的引物组，还包括taqdna聚合酶和ddh2o。在一些优选的实施情况中还包括阳性对照品和阴性对照品。

7、此外，本发明还提供了一种检测气单胞菌的方法，包括以下步骤：(1)提取样品dna，采用上述的引物组进行pcr扩增；(2)凝胶电泳(优选采用琼脂糖凝胶电泳进行检测)检测pcr扩增产物，根据电泳后条带判断样品中是否存在气单胞菌。该方法能够用于快速准确的检测水体或动物组织(主要是水生动物)中的气单胞菌。

8、其中，在上述方法中，所述pcr反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，再在72℃延伸反应7min。发明人经过探究发现，当退火温度为57℃时，条带最清晰，条带更粗，表明扩增量最大；而当选择62℃条件时几乎没有条带，故本发明优选退火温度为57℃。

9、而对应的pcr的反应体系为25μl，包括2×pcr mix 12.5μl，上游引物aer-1f 1μl，下游引物aer-1r 1μl，ddh2o 9.5μl，模板1μl。

10、本发明的有益效果为：本发明提供了一种新的遗传标记aer-1作为气单胞菌的新靶标，并设计了对应的引物组，基于该引物组提出的检测方法特异性强，灵敏度高，其对气单胞菌属细菌dna核酸检测灵敏度能够达到7.415×10-5ng/μl，能够快速准确的从多种生物和环境样品中检测气单胞菌。此外，基于新的遗传标记aer-1的试剂盒和检测方法还能够分析环境中气单胞菌属细菌，如达卡气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌以及温和气单胞菌等的多态性分布丰度，各气单胞菌属细菌能够很好地区分开，聚类分析各自聚为一支。

技术特征：

1.一种用于检测气单胞菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物aer-1f和下游引物aer-1r，所述上游引物aer-1f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物aer-1r的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述引物组的靶标基因为气单胞菌的aer-1，所述aer-1的核苷酸序列如seq id no.3所示。

2.权利要求1所述的引物组在制备检测气单胞菌的产品中的应用。

3.一种检测气单胞菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组，还包括taqdna聚合酶和ddh2o。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和阴性对照品。

5.一种非诊断或治疗目的的检测气单胞菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样品dna，采用权利要求1所述的引物组进行pcr扩增；(2)凝胶电泳检测pcr扩增产物，根据电泳后条带判断样品中是否存在气单胞菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pcr反应条件为：94℃预变性4mi n，然后94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，再在72℃延伸反应7min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pcr的反应体系为25μl，包括2×pcrmix 12.5μl，所述上游引物aer-1f 1μl，所述下游引物aer-1r 1μl，ddh2o 9.5μl，模板1μl。

8.权利要求5至7任一项所述的方法在检测水体或动物组织中的气单胞菌中的应用。

9.权利要求1所述的引物组在水体中气单胞菌属多态性丰度分析中的应用。

10.一种用于水体中气单胞菌属多态性丰度分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取水体样品的总dna，采用权利要求1所述的引物组进行扩增，扩增产物建库，通过高通量测序与所述aer-1进行比对，从而获得所述水体样品中气单胞菌属的分布丰度。

技术总结
本发明属于分子生物学领域，具体公开了一种用于检测气单胞菌的引物组、试剂盒、方法及应用。该引物组包括上游引物AER‑1F和下游引物AER‑1R，上游引物AER‑1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物AER‑1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供了一种新的遗传标记AER‑1作为气单胞菌的新靶标，并设计了对应的引物组，基于该引物组提出的检测方法特异性强，灵敏度高，对于气单胞菌核酸检测灵敏度能够达到7.415×10‑5ng/μL，能够快速准确检测包括达卡气单胞菌在内的气单胞菌属细菌，又能分析气单胞菌在环境中的多态性分布丰度。

技术研发人员：徐先栋,付辉云,黄江峰,周智勇,万锦涛
受保护的技术使用者：江西省水产科学研究所（江西省鄱阳湖渔业研究中心、江西省渔业资源生态环境监测中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14