一种微生物-肠-骨轴仿生芯片及其构建方法和应用

本发明涉及仿生芯片，尤其涉及一种微生物-肠-骨轴仿生芯片及其构建方法和应用。

背景技术：

1、越来越多的证据表明，肠道微生物参与维持骨骼内环境的稳定，保护骨骼健康。在骨骼生长发育中，肠道微生物通过调节营养吸收和代谢产物，改变肠黏膜上皮结构以及调控机体免疫系统，介导肠道屏障的信号转导等方式成为调节机体骨骼代谢的重要介质。然而，复杂的微生物-肠-骨轴调控机制尚未完全阐明，特别是肠道微生物与骨骼系统疾病的因果关系还有待进一步研究。同时，微生物-肠-骨轴已成为有效预防和治疗骨骼系统疾病的潜在靶标，一系列可以影响微生物-肠-骨轴的物质，如益生菌，益生元，药物等可能开发为新的干预措施。由此可见，构建微生物-肠-骨轴体外模型，对于研究肠道微生物与骨骼系统作用的分子机制、肠道菌群与骨骼疾病的因果关系以及基于微生物-肠-骨轴发挥作用的药物或益生菌的评价和筛选研究等起着至关重要的支撑作用。

2、微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在体内组织和器官的模拟与应用领域展现了其独特的魅力和优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同体内生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种微生物和细胞功能研究等特点而成为新一代人体组织工程研究的重要平台。

3、体外细胞培养不能真实地反映人体内的微环境，而仿生芯片可在体外模拟人体不同组织器官的主要结构功能特征和复杂的器官间联系，可以反映人体各器官对药物或外界不同刺激产生的反应，在生命科学和医学研究、新药研发、个性化医疗、毒性预测和生物防御等领域具有广泛的应用前景。现有的体外仿生芯片有模拟肠道微生物与肠上皮细胞之间相互作用的肠道芯片，可模拟肠道、血脑屏障和大脑单元的芯片等，但还未见把肠道单元与骨骼组织有机结合起来，可模拟体内微生物-肠-骨轴代谢过程的仿生微流控芯片。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种微生物-肠-骨轴仿生芯片及其构建方法和应用，该仿生芯片基于微流控技术构建而得，可以模拟微生物-肠-骨轴的吸收代谢、免疫调控、激素信号传导等过程，用以开展微生物-肠-骨轴分子机制、肠道菌群与骨骼系统疾病的因果关系以及基于微生物-肠-骨轴发挥作用的药物和益生菌的评价和筛选研究。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种微生物-肠-骨轴仿生芯片，包括上盖板和下盖板，其特征在于：所述上盖板和下盖板之间从上往下依次设有第一层芯片、第二层芯片、第三层芯片和第四层芯片；所述第二层芯片上设置有多个用于接种两种肠组织细胞模拟肠道单元的小细胞培养池，所述第四层芯片上设置有多个用于接种成骨细胞模拟骨组织单元的大细胞培养池，所述第一层芯片、第二层芯片、第三层芯片和第四层芯片之间贯通设有与所述小细胞培养池和大细胞培养池连通的细胞培养液内部通道。

4、进一步的，所述细胞培养液内部通道包括设置在所述第一层芯片顶部的多个细胞液进通道和细胞液出通道，所述细胞液进通道和细胞液出通道均贯穿所述第一层芯片；其中一部分细胞液进通道和细胞液出通道与所述小细胞培养池垂直连通，另外一部分细胞液进通道和细胞液出通道与所述大细胞培养池垂直连通。

5、进一步的，所述第二层芯片上开设有与所述小细胞培养池相对应的第一进液口和第一出液口，所述第一进液口和第一出液口与相互对应的细胞液进通道和细胞液出通道垂直连通；

6、每个所述第一进液口与相互对应的第一出液口之间通过第一流动通道连通，所述小细胞培养池位于相互对应的第一流动通道中段，且所述小细胞培养池、第一进液口、第一出液口和所述第一流动通道均贯穿所述第二层芯片。

7、进一步的，所述第四层芯片上开设有与所述大细胞培养池相对应的第二进液口和第二出液口，所述第二进液口和第二出液口与相互对应的细胞液进通道和细胞液出通道垂直连通；

8、每个所述第二进液口与相互对应的第二出液口之间通过第二流动通道连通，所述大细胞培养池位于相互对应的第二流动通道的中段，且所述大细胞培养池、第二进液口、第二出液口和所述第二流动通道均贯穿所述第四层芯片。

9、进一步的，所述第二层芯片和第三层芯片上均开设有用于连通第二进液口与相互对应的细胞液进通道的进液连接通孔，以及用于连通第二出液口与相互对应的细胞液出通道之间的出液连接通孔，所述第三层芯片上的进液连接通孔和出液连接通孔之间通过第三流动通道连通，所述第三流动通道的中段设有连通培养池。

10、进一步的，所述细胞液进通道和细胞液出通道的内径为1.5mm，第一流动通道、第二流动通道和第三流动通道的内径为1mm；所述小细胞培养池、连通培养池的直径为5mm，所述大细胞培养池的直径为8mm。

11、进一步的，所述模拟肠道单元包括接种有人结直肠腺癌细胞caco-2的pc多孔膜，以及接种有人肠微血管内皮细胞himec的pc多孔膜，人结直肠腺癌细胞caco-2朝上放置，人肠微血管内皮细胞himec朝下放置；且在人结直肠腺癌细胞caco-2中添加有肠道菌悬液。

12、进一步的，所述模拟骨组织单元包括接种有人成骨细胞mg-63的pc多孔膜，人成骨细胞mg-63朝上放置。

13、进一步的，一种微生物-肠-骨轴仿生芯片的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，

14、s1：采用3d打印技术制备微流控的第一层芯片、第二层芯片、第三层芯片和第四层芯片；

15、s2：在第二层芯片的小细胞培养池中接种两种肠组织细胞模拟肠道单元；

16、s3：在第四层芯片的大细胞培养池中接种成骨细胞模拟骨组织单元；

17、s4：将第一层芯片、第二层芯片、第三层芯片和第四层芯片用上盖板和下盖板夹紧固定，即得微生物-肠-骨轴仿生芯片。

18、进一步的，一种微生物-肠-骨轴仿生芯片在研究肠道菌群与骨代谢作用的分子机制、肠道菌群与骨代谢疾病的因果关系以及评价和筛选基于微生物-肠-骨轴发挥作用的药物和益生菌中的应用。

19、本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的改进之处在于，

20、1、本发明中的微生物-肠-骨轴仿生芯片，将肠道微生物、模拟肠道单元和模拟骨组织单元有机的整合在一个芯片上，构建了一个能够模拟体内微生物-肠-骨轴吸收、代谢、调控和传导过程的体系，解决了芯片功能单一化问题，引入肠道微生物使所述芯片更接近体内真实微环境，更容易在骨骼系统疾病防治领域发现新的疗法，并推动个性化医疗的发展。

21、2、本发明中的微生物-肠-骨轴仿生芯片通过双通道结构的设置方式，可以同时模拟体微生物-肠-骨轴的吸收代谢、免疫调控、激素信号传导等过程，从而可以使其适用于肠道菌群与骨代谢作用的分子机制、肠道菌群与骨代谢疾病的因果关系以及评价和筛选基于微生物-肠-骨轴发挥作用的药物和益生菌的研究中。

技术特征：

1.一种微生物-肠-骨轴仿生芯片，包括上盖板(1)和下盖板(6)，其特征在于：所述上盖板(1)和下盖板(6)之间从上往下依次设有第一层芯片(2)、第二层芯片(3)、第三层芯片(4)和第四层芯片(5)；所述第二层芯片(3)上设置有多个用于接种两种肠组织细胞模拟肠道单元的小细胞培养池(301)，所述第四层芯片(5)上设置有多个用于接种成骨细胞模拟骨组织单元的大细胞培养池(501)，所述第一层芯片(2)、第二层芯片(3)、第三层芯片(4)和第四层芯片(5)之间贯通设有与所述小细胞培养池(301)和大细胞培养池(501)连通的细胞培养液内部通道。

2.根据权利要求1所述的一种微生物-肠-骨轴仿生芯片，其特征在于：所述细胞培养液内部通道包括设置在所述第一层芯片(2)顶部的多个细胞液进通道(201)和细胞液出通道(202)，所述细胞液进通道(201)和细胞液出通道(202)均贯穿所述第一层芯片(2)；其中一部分细胞液进通道(201)和细胞液出通道(202)与所述小细胞培养池(301)垂直连通，另外一部分细胞液进通道(201)和细胞液出通道(202)与所述大细胞培养池(501)垂直连通。

3.根据权利要求2所述的一种微生物-肠-骨轴仿生芯片，其特征在于：所述第二层芯片(3)上开设有与所述小细胞培养池(301)相对应的第一进液口(302)和第一出液口(303)，所述第一进液口(302)和第一出液口(303)与相互对应的细胞液进通道(201)和细胞液出通道(202)垂直连通；

4.根据权利要求3所述的一种微生物-肠-骨轴仿生芯片，其特征在于：所述第四层芯片(5)上开设有与所述大细胞培养池(501)相对应的第二进液口(502)和第二出液口(503)，所述第二进液口(502)和第二出液口(503)与相互对应的细胞液进通道(201)和细胞液出通道(202)垂直连通；

5.根据权利要求4所述的一种微生物-肠-骨轴仿生芯片，其特征在于：所述第二层芯片(3)和第三层芯片(4)上均开设有用于连通第二进液口(502)与相互对应的细胞液进通道(201)的进液连接通孔(401)，以及用于连通第二出液口(503)与相互对应的细胞液出通道(202)之间的出液连接通孔(402)，所述第三层芯片(4)上的进液连接通孔(401)和出液连接通孔(402)之间通过第三流动通道(403)连通，所述第三流动通道(403)的中段设有连通培养池(404)。

6.根据权利要求5所述的一种微生物-肠-骨轴仿生芯片，其特征在于：所述细胞液进通道(201)和细胞液出通道(202)的内径为1.5mm，第一流动通道(404)、第二流动通道(504)和第三流动通道(403)的内径为1mm；所述小细胞培养池(301)、连通培养池(404)的直径为5mm，所述大细胞培养池(501)的直径为8mm。

7.根据权利要求1所述的一种微生物-肠-骨轴仿生芯片，其特征在于：所述模拟肠道单元包括接种有人结直肠腺癌细胞caco-2的pc多孔膜，以及接种有人肠微血管内皮细胞himec的pc多孔膜，人结直肠腺癌细胞caco-2朝上放置，人肠微血管内皮细胞himec朝下放置；且在人结直肠腺癌细胞caco-2中添加有肠道菌悬液。

8.根据权利要求1所述的一种微生物-肠-骨轴仿生芯片，其特征在于：所述模拟骨组织单元包括接种有人成骨细胞mg-63的pc多孔膜，人成骨细胞mg-63朝上放置。

9.如权利要求3-8任一项所述的一种微生物-肠-骨轴仿生芯片的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，

10.如权利要求1-8任一项所述的一种微生物-肠-骨轴仿生芯片在研究肠道菌群与骨代谢作用的分子机制、肠道菌群与骨代谢疾病的因果关系以及评价和筛选基于微生物-肠-骨轴发挥作用的药物和益生菌中的应用。

技术总结
本发明公开了一种微生物‑肠‑骨轴仿生芯片及其构建方法和应用，属于仿生芯片技术领域，该微生物‑肠‑骨轴仿生芯片由双通道结构组成，第一层芯片和第二层芯片形成细胞培养液内部通道，封接后与第三层芯片构成上层芯片，第三层芯片底部压紧设置有第四层芯片，形成下层芯片；上层芯片内放置接种有两种肠组织细胞的PC多孔膜，同时注入肠道菌悬液，形成模拟肠道单元；下层芯片内放置接种有人成骨细胞的PC多孔膜，形成模拟骨组织单元；该仿生芯片可以模拟微生物‑肠‑骨轴的吸收代谢、免疫调控、激素信号传导等过程，从而应用于微生物‑肠‑骨轴分子机制、肠道菌群与骨骼系统疾病的因果关系以及相关药物和益生菌的评价和筛选的研究。

技术研发人员：牛银波,任丽,张晓燕,李志华,李琛
受保护的技术使用者：西北工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13