一种工程菌及利用该工程菌制备D-焦谷氨酸的方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种用于制备d-焦谷氨酸的工程菌及利用该工程菌制备d-焦谷氨酸的方法。

背景技术：

1、d-焦谷氨酸(d-pyroglutamic acid)又称d-5-氧代脯氨酸(d-5-oxoproline)或(r)-2-吡咯烷酮-5-羧酸，是一种有效的内源性代谢物质，可对抗由n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂ap-5诱导的被动回避行为的中断。具有如下结构：

2、

3、其作为前体被广泛应用于精细化工产品和药物的生产，如法索西坦(fasoracetam)。法索西坦是一种促智药物，可增进脑功能、改善学习记忆能力，也可用于脑血管疾病如阿尔兹海默病(ad)的治疗，目前处于ⅲ临床试验阶段。

4、d-焦谷氨酸的制备主要是通过化学合成的，文献报道涉及d-焦谷氨酸化学合成的方法有廖晓垣以l-谷氨酸为起始原料经190℃高温融溶脱水焦化成dl-焦谷氨酸后，再用2nhcl加热水解得dl-谷氨酸，利用优先结晶法拆分获得d-谷氨酸；最后将d-谷氨酸加热焦化获得d-焦谷氨酸，含量约95％。此合成方法工艺复杂，操作要求较为严格，生产涉及到高温和使用大量酸水解，生产成本较高且对环境不友好，产品质量差，混有l-焦谷氨酸和d-谷氨酸。

5、生物酶法生产化合物是一种高效、环保、可重复使用的化合物合成方法，但是生物酶法合成d-焦谷氨酸未见文献报道，主要原因为生物酶法存在生产成本较高，催化效率不够高，反应速度较慢等缺点，因此开发生物酶法生产d-焦谷氨酸并在实际应用中加以应用是具有挑战的。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于制备d-焦谷氨酸的工程菌及利用该工程菌制备d-焦谷氨酸的方法，所述方法具有原料价格低廉、转化率高、产品质量好且对环境友好，适合工业化生产。

2、本发明提供了一种工程菌的表达方法，所述工程菌包括glur工程菌和dglucy工程菌，包括步骤：

3、s1、构建重组表达质粒pet32a-glur，化转大肠杆菌bl21(de3)中，获得重组工程菌glur。s2、构建重组表达质粒pet32a-dglucy，化转大肠杆菌bl21(de3)中，获得重组工程菌dglucy。

4、s3、发酵获得表达glur酶的glur工程菌和表达dglucy酶的dglucy工程菌。

5、另一方面，本发明提供了一种用于生产d-焦谷氨酸的工程菌，表达glur酶的glur工程菌和表达dglucy酶的dglucy工程菌。所述工程菌由前述表达方法得到。

6、所述glur工程菌为pet32a-glur/bl21(de3)，所述dglucy工程菌为pet32a-dglucy/bl21(de3)。

7、其中，所述glur工程菌包含pet32a-glur表达质粒。

8、glur基因序列为seq id no:1。

9、其中，所述dglucy工程菌包含pet32a-dglucy表达质粒。

10、dglucy基因序列为seq id no:2。

11、再一方面，本发明提供了一种d-焦谷氨酸的制备方法，添加l-谷氨酸钠，四水氯化锰，glur菌体细胞，dglucy菌体细胞，调节ph，搅拌转化反应直至反应底物转化完全或产物生成量不再增加得到含有d-焦谷氨酸的酶催化反应液。

12、优选的，所述l-谷氨酸钠为一水合物。

13、优选的，所述l-谷氨酸钠与四水氯化锰的摩尔用量比为(1～2):1，进一步优选的，所述l-谷氨酸钠与四水氯化锰的摩尔用量比为1.5:1。

14、优选的，所述l-谷氨酸钠与glur菌体细胞重量比为(30-10)：1，进一步优选的，所述l-谷氨酸钠与glur菌体细胞重量比为(20-15)：1，最为优选的，所述l-谷氨酸钠与glur菌体细胞重量比为(18-15)：1。

15、优选的，所述l-谷氨酸钠与dglucy菌体细胞重量比为(30-10)：1，进一步优选的，所述l-谷氨酸钠与dglucy菌体细胞重量比为(20-15)：1，最为优选的，所述l-谷氨酸钠与dglucy菌体细胞重量比为(18-15)：1。

16、优选的，所述glur菌体细胞与dglucy菌体细胞重量比1:(1-3)，优选为1:(1-2)。

17、优选的，反应体系ph为6-10，进一步优选的，反应体系的ph为7-8，最为优选的，反应体系的ph为8。

18、优选的，反应温度为30-40℃，进一步优选的，反应温度为37-40℃，最为优选的，反应温度为37℃。

19、进一步的，所述工程菌在用于制备d-焦谷氨酸的方法，进一步包括步骤，将酶催化反应液升温，搅拌，离心进行固液分离，上清液经微滤超滤后，再经离子交换树脂和浓缩结晶得到所述d-焦谷氨酸。

20、优选的，将酶催化反应液升温至50-70℃。

21、优选的，搅拌10-120min。

22、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明不使用大量盐酸和高温条件(190℃以上)，安全性好。本发明的转化率高、原料价格低廉，反应条件温和且产品质量好纯度高，适用于工业化生产。本发明首次采用酶催化合成d-焦谷氨酸的工程菌进行“一锅法”酶催化制备d-焦谷氨酸，来替代传统的化学合成法，为d-焦谷氨酸的制备开辟了新思路。

技术特征：

1.一种工程菌的表达方法，所述工程菌包括glur工程菌和dglucy工程菌，包括步骤：

2.一种工程菌，包括表达glur酶的glur工程菌和表达dglucy酶的dglucy工程菌，所述工程菌由权利要求1所述的表达方法得到。

3.根据权利要求2所述的工程菌，所述glur工程菌包含pet32a-glur表达质粒；所述dglucy工程菌包含pet32a-dglucy表达质粒。

4.根据权利要求3所述的工程菌，其中glur基因序列为seq id no:1，dglucy基因序列为seq id no:2。

5.权利要求2-4任一权利要求所述的工程菌的用于制备d-焦谷氨酸的用途。

6.一种d-焦谷氨酸的制备方法，添加l-谷氨酸钠，四水氯化锰，glur菌体细胞，dglucy菌体细胞，调节ph，搅拌转化反应直至反应底物转化完全或产物生成量不再增加得到含有d-焦谷氨酸的酶催化反应液。

7.根据权利要求6所述的制备方法，所述l-谷氨酸钠为一水合物；所述l-谷氨酸钠与四水氯化锰的摩尔用量比为(1～2):1，进一步优选的，所述l-谷氨酸钠与四水氯化锰的摩尔用量比为1.5:1；所述l-谷氨酸钠与glur菌体细胞重量比为(30-10)：1，进一步优选的，所述l-谷氨酸钠与glur菌体细胞重量比为(20-15)：1，最为优选的，所述l-谷氨酸钠与glur菌体细胞重量比为(18-15)：1；所述l-谷氨酸钠与dglucy菌体细胞重量比为(30-10)：1，进一步优选的，所述l-谷氨酸钠与dglucy菌体细胞重量比为(20-15)：1，最为优选的，所述l-谷氨酸钠与dglucy菌体细胞重量比为(18-15)：1。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述glur菌体细胞与dglucy菌体细胞重量比1:(1-3)，优选为1:(1-2)。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述ph为6-10，进一步优选的，ph为7-8，最为优选的，ph为8；反应温度为30-40℃，进一步优选的，反应温度为37-40℃，最为优选的，反应温度为37℃。

10.根据权利要求6所述的制备方法，进一步包括步骤，将酶催化反应液升温，搅拌，离心进行固液分离，上清液经微滤超滤后，再经离子交换树脂和浓缩结晶得到所述d-焦谷氨酸。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，公开了一种工程菌及利用该工程菌制备D‑焦谷氨酸的方法。其中所述工程菌的由下述表达方法得到：S1、构建重组表达质粒pET32a‑GluR，化转大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组工程菌GLUR；S2、构建重组表达质粒pET32a‑Dglucy，化转大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组工程菌DGLUCY；S3、发酵获得表达GLUR酶的GLUR工程菌和表达DGLUCY酶的DGLUCY工程菌。该方法具有原料价格低廉、转化率高、反应条件温和且产品质量好纯度高，适用于工业化生产。

技术研发人员：李晚军,柴保中,王文涛,王振栋
受保护的技术使用者：安徽普利药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23