基于麦胚的体外蛋白表达方法与流程

本发明涉及蛋白质合成，具体的，涉及一种基于麦胚的体外蛋白表达方法。

背景技术：

1、蛋白质是生物体内重要的大分子，是细胞的重要组分。人的生长发育、健康、疾病和蛋白质具有非常紧密的关系。蛋白质是成药位点，很多药物都靶向到蛋白质上，达到治疗疾病的目的。要进行药物的设计，就要对不同蛋白质的结构与功能进行分析，对不同蛋白质的结构与功能进行分析的前提是进行蛋白质的表达与纯化。

2、传统的蛋白表达纯化的方法，是构建蛋白表达载体，转化到原核蛋白表达菌株中，进行诱导、表达与纯化，然后进行后续研究。这种方法要进行载体构建、转化克隆宿主菌、鉴定阳性克隆、提取表达载体、转化蛋白表达宿主菌、鉴定阳性克隆、小量培养、小量诱导检测目的蛋白是否表达、大量培养、诱导蛋白表达、离心收集菌体、超声破碎裂解、低温离心、与树脂填料结合、过柱纯化。传统方法过程繁琐、需要很多仪器和设备、目的蛋白有可能无法正常表达、耗时很长(一个月到六个月)、成功率低。因此需要开发一种反应流程简便，反应时间短的蛋白表达方法，提高蛋白表达的效率。

技术实现思路

1、本发明提出一种基于麦胚的体外蛋白表达方法，解决了相关技术中目的蛋白表达耗时长的问题。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种基于麦胚的体外蛋白表达预混液，包括麦胚抽提物、底物缓冲液和肌酸激酶溶液，所述底物缓冲液包括100mm hepes、350mm醋酸钾、12mm醋酸镁、2.5mm亚精胺、25mm二硫苏糖醇、6mm氨基酸、120mm磷酸肌酸。

4、作为进一步技术方案，所述麦胚抽提物的制备方法为：

5、s1、将麦胚依次使用裂解液、超纯水清洗，加入液氮研磨；

6、s2、加入提取缓冲液混合后，离心，取上清液；

7、s3、将上清液过柱后，冷冻，得到麦胚抽提物。

8、作为进一步技术方案，所述s1中裂解液为np-40裂解液。

9、作为进一步技术方案，所述s2中提取缓冲液为：100mm hepes、400mm醋酸钾、20mm醋酸镁、6mm氯化钙、12mm氨基酸和1mm二硫苏糖醇。

10、作为进一步技术方案，所述s3中过柱为将上清液依次经提取缓冲液预平衡凝胶柱和底物缓冲液预平衡凝胶柱进行处理。

11、作为进一步技术方案，所述提取缓冲液预平衡凝胶柱填料包括100mm hepes、400mm醋酸钾、20mm醋酸镁、6mm氯化钙、12mm氨基酸和1mm二硫苏糖醇。

12、作为进一步技术方案，所述底物缓冲液预平衡凝胶柱填料包括100mm hepes、350mm醋酸钾、12mm醋酸镁、2.5mm亚精胺、25mm二硫苏糖醇、6mm氨基酸、120mm磷酸肌酸。

13、作为进一步技术方案，所述肌酸激酶溶液的浓度为50mg/ml。

14、一种基于麦胚的体外蛋白表达方法，将目的基因与所述的基于麦胚的体外蛋白表达预混液混合，反应，得到目的蛋白；所述目的基因包括环状双链dna、线状双链dsdna、mrna中的一种；所述目的基因经克隆得到，所述转录过程中启动子包括t7、tac、sp6中的一种。

15、作为进一步技术方案，所述反应温度为30℃，反应时间2-4h。

16、本发明的工作原理及有益效果为：

17、1、本发明中，对体外蛋白表达预混液进行优化设计，体外蛋白预混液包括麦胚抽提物、底物缓冲液和肌酸激酶溶液，底物缓冲液中将醋酸镁、亚精胺、二硫苏糖醇、氨基酸、磷酸肌酸的浓度增大，将醋酸钾的浓度减少，并且添加了氨基酸，通过上述的优化设计使得该体外蛋白表达预混液与蛋白表达载体混合用于体外蛋白表达时，反应时间短，只需在30℃下反应2-4h，即可获得目的蛋白，与现有技术相比，极大的缩短了反应流程、节约了时间、提高了效率，而且可以实现高通量反应，在食品、医学、疫苗、医美、农业等领域，具有广阔的市场前景与重要的应用价值。

18、2、本发明中麦胚抽提物在制备过程中依次经提取缓冲液预平衡凝胶柱和底物缓冲液预平衡凝胶柱进行处理，提高了蛋白合成产量。

19、3、本发明使用高精度研磨仪，能够对麦胚进行精细研磨、精准和完整的分离，使用溶剂浮选技术筛选麦胚颗粒，能够保证麦胚的高度完整度和一致性。获得的麦胚完整度高，一致性强，具有活性。在液氮下进行研磨，能够保证麦胚提取物的高活性。使用低温超纯水和np-40溶液进行严苛的洗涤，能够去除抑制蛋白表达的rip，保证蛋白表达的高效性。反应预混液中含有atp再生体系，保证增加蛋白合成的顺利进行。体外进行蛋白表达，能够大幅度缩短蛋白表达的时间，降低蛋白表达纯化的成本，避免了体内蛋白表达对宿主菌的毒性，针对不同要求可以对反应体系进行定制化(如进行蛋白质翻译后修饰)，能够实现高通量筛选(如一次实验可以建立384个反应)，反应体系既可以放大也可以缩小(反应体积可以从几十微升到几十升)。

20、4、本发明体外蛋白表达方法不需要进行表达载体转化到宿主菌里，只需要构建好蛋白表达载体就可直接用于蛋白表达。并且本发明中的方法对蛋白表达载体的兼容性高，可以使用环状质粒、线性模板、mrna，对启动子的兼容性强，可以使用t7、tac、sp6。

技术特征：

1.一种基于麦胚的体外蛋白表达预混液，其特征在于，包括麦胚抽提物、底物缓冲液和肌酸激酶溶液，所述底物缓冲液包括100mm hepes、350mm醋酸钾、12mm醋酸镁、2.5mm亚精胺、25mm二硫苏糖醇、6mm氨基酸、120mm磷酸肌酸。

2.根据权利要求1所述的一种基于麦胚的体外蛋白表达预混液，其特征在于，所述麦胚抽提物的制备方法为：

3.根据权利要求2所述的一种基于麦胚的体外蛋白表达预混液，其特征在于，所述s1中裂解液为np-40裂解液。

4.根据权利要求2所述的一种基于麦胚的基于麦胚的体外蛋白表达预混液，其特征在于，所述s2中提取缓冲液为：100mm hepes、400mm醋酸钾、20mm醋酸镁、6mm氯化钙、12mm氨基酸和1mm二硫苏糖醇。

5.根据权利要求2所述的一种基于麦胚的体外蛋白表达预混液，其特征在于，所述s3中过柱为将上清液依次经提取缓冲液预平衡凝胶柱和底物缓冲液预平衡凝胶柱进行处理。

6.根据权利要求5所述的一种基于麦胚的体外蛋白表达预混液，其特征在于，所述提取缓冲液预平衡凝胶柱填料包括100mm hepes、400mm醋酸钾、20mm醋酸镁、6mm氯化钙、12mm氨基酸和1mm二硫苏糖醇。

7.根据权利要求5所述的一种基于麦胚的体外蛋白表达预混液，其特征在于，所述底物缓冲液预平衡凝胶柱填料包括100mm hepes、350mm醋酸钾、12mm醋酸镁、2.5mm亚精胺、25mm二硫苏糖醇、6mm氨基酸、120mm磷酸肌酸。

8.根据权利要求1所述的一种基于麦胚的体外蛋白表达预混液，其特征在于，所述肌酸激酶溶液的浓度为50mg/ml。

9.一种基于麦胚的体外蛋白表达方法，其特征在于，将目的基因与权利1-8任意一项所述的基于麦胚的体外蛋白表达预混液混合，反应，得到目的蛋白；所述目的基因包括环状双链dna、线状双链dsdna、mrna中的一种；所述目的基因经克隆得到，所述转录过程中启动子包括t7、tac、sp6中的一种。

10.根据权利要求9所述的一种基于麦胚的体外蛋白表达方法，其特征在于，所述反应温度为30℃，反应时间2-4h。

技术总结
本发明涉及蛋白质合成技术领域，提出了一种基于麦胚的体外蛋白表达方法，包括麦胚抽提物、底物缓冲液和肌酸激酶溶液，所述底物缓冲液包括100mM HEPES、350mM醋酸钾、12mM醋酸镁、2.5mM亚精胺、25mM二硫苏糖醇、6mM氨基酸、120mM磷酸肌酸。通过上述技术方案，解决了现有技术中目的蛋白表达耗时长的问题。

技术研发人员：赵瑞,梁杉,王翊静
受保护的技术使用者：保定米奇生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12