降解磺胺甲恶唑的脱氮副球菌及其应用

本发明涉及降解磺胺甲恶唑的脱氮副球菌及其应用，属于合成生物学领域。

背景技术：

1、磺胺类药物是一类广谱抗菌药物，在兽医临床和畜牧业中预防和治疗传染病。然而，抗生素的滥用已经导致了越来越多的环境问题。它们在环境中的累积残留物会减少土壤真菌的数量，改变微生物群落的结构，降低土壤肥力。在进入水体时，它们会危及水生动物，破坏生态系统的稳定，影响水产养殖业的健康发展。此外，它们难以降解，低浓度就有很高的生态毒性，并引起耐药性的扩散。因此，磺胺类药物污染对生态环境和人类健康构成了巨大的威胁。因此，高效去除磺胺类药物并降低其毒性是确保再生水安全使用的必然要求。用于治疗传染病的磺胺甲恶唑是最经常使用的磺胺类抗生素之一、磺胺甲恶唑及其代谢物通过尿液或粪便排泄到环境中。因此，磺胺甲恶唑在环境中的主要来源包括污水、医院、水产养殖场、制药业和地表水。研究表明，磺胺甲恶唑可能具有直接的神经毒性，与人类的肠道传输改变和神经精神并发症等副作用直接相关，危及人类健康。此外，由于其急性毒性，它对水生生物构成潜在的生态风险。因此，提高磺胺甲恶唑的降解效果是目前备受人们关注的热点。

2、为了进一步提高降解效果，可以使用代谢工程来改造磺胺甲恶唑降解菌株，提高其降解效果。然而目前筛选出的磺胺甲恶唑降解菌株，由于缺乏代谢调控工具和方法，以及降解机制和关键基因不明确，很难进行工程化。因此使用可遗传的环境微生物作为代谢工程的底盘细胞是加强磺胺甲恶唑降解和环境治理的一个可行方法。为了实现这一目的，首先，我们要有一个清晰的磺胺甲恶唑降解代谢途径。最近，ricken等人分离出一株微杆菌br1，能够以磺胺甲恶唑作为唯一碳源进行代谢生长。这种细菌有一个执行降解功能的sad基因簇，由三个功能基因组成，两个单氧酶基因(sada，sadb)和一个fmn还原酶基因(sadc)。通过sada和sadb酶的作用，磺胺甲恶唑在fmnh2的协助下最终产生了3-氨基-5-甲基异恶唑，偏苯三酚和so2(图1)。这是迄今为止唯一在生化和分子生物学水平上得到验证的文献报告，为本次研究代谢工程以加强磺胺甲恶唑的降解提供了理论基础。另外，实验室从污水中分离的脱氮副球菌，可以利用不同碳源，适应极端环境能力强；本身也具有脱氮的功能，对有机污染物有很高的降解能力；且操作系统较为成熟，遗传稳定。因此通过代谢改造以脱氮副球菌为底盘细胞构建工程菌，可以提高环境微生物降解磺胺类污染物的能力，同时也为构建人工降解菌群奠定基础。

技术实现思路

1、本发明提供了脱氮副球菌降解磺胺甲恶唑菌株，所述降解基因经脱氮副球菌内源性启动子优化后，基因的转录水平提升，脱氮副球菌降解磺胺甲恶唑的效率增强。

2、在一种实施方式中，所述脱氮副球菌以seq id no.9～12任一所示的启动子表达磺胺甲恶唑降解途径的相关基因。

3、在一种实施方式中，所述磺胺甲恶唑降解途径的相关基因包括但不限于sada、sadb、sadc、ssue、rutf、coga、sutr、psuk中的一种或多种。

4、在一种实施方式中，所述脱氮副球菌表达了sada、sadb基因，并以seq id no.9～12任一所示启动子调控sadc、ssue、rutf、coga、sutr或psuk的表达。

5、在一种实施方式中，降解基因sada和sadb来源于微杆菌br1基因组，fmn还原酶基因fmnr(即sadc来源于微杆菌br1基因组，ssue和rutf来源于大肠杆菌mg1655基因组，coga来源于谷氨酸棒状杆菌atcc 13032基因组，sutr来源于枯草芽孢杆菌srcm102756基因组，psuk来源于普氏假单胞菌kt2440基因组)，但不限于以上来源。

6、在一种实施方式中，所述sada基因具有seq id no.1所示的核苷酸序列；所述sadb基因具有seq id no.2所示的核苷酸序列；所述sadc基因具有seq id no.3所示的核苷酸序列；所述ssue基因具有seq id no.4所示的核苷酸序列；所述rutf基因具有seq id no.5所示的核苷酸序列；所述coga基因具有seq id no.6所示的核苷酸序列；所述sutr基因具有seq id no.7所示的核苷酸序列；所述psuk基因具有seq id no.8所示的核苷酸序列。

7、在一种实施方式中，所述脱氮副球菌为脱氮副球菌(paracoccus denitrificans)dytn-1，于2016年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m2016741，已公开于论文《脱氮副球菌dytn-1高效去除污水中的总氮》。

8、在一种实施方式中，以质粒piab4为表达载体表达所述基因。

9、在一种实施方式中，所述质粒piab4是以质粒pind4为骨架，以pglna启动子调控sada和sadb基因的起始转录。

10、在一种实施方式中，所述脱氮副球菌以质粒piab4为表达载体，用启动子prho调控sadc基因的表达；用启动子pcs调控coga基因或sutr基因的表达，用启动子prho调控psuk基因或rutf基因的表达，用启动子pnir调控psuk基因或ssue基因的表达。

11、本发明还提供了含有所述脱氮副球菌的微生物制剂。

12、本发明还提供了启动子在促进脱氮副球菌中蛋白表达方面的应用，所述启动子具有如seq id no.9，seq id no.10，seq id no.11，和seq id no.12所示的dna序列，并能够启动目的蛋白在脱氮副球菌中的转录。

13、本发明还提供了所述脱氮副球菌在降解磺胺甲恶唑中的应用。

14、在一种实施方式中，所述应用包括但不限于将所述脱氮副球菌在含磺胺甲恶唑的环境中培养。

15、本发明还提供所述脱氮副球菌在降解磺胺类污染物中的应用。

16、有益效果：

17、(1)本发明提供了一种磺胺甲恶唑降解思路，通过以环境微生物为底盘细胞，运用合成生物技术和代谢工程在新的微生物中构造磺胺甲恶唑降解途径，该技术方案为提高微生物对磺胺甲恶唑的降解能力及构建人工降解菌群奠定基础。

18、(2)本发明提供了脱氮副球菌dytn-1内源启动子，该启动子在脱氮副球菌有较好的表达，对表达强度高达2～25.3倍。该启动子作为基因表达调控元件，用于精细调控降解基因的表达，精细调控代谢通路，具有广泛的应用前景。

技术特征：

1.一种脱氮副球菌，其特征在于，以seq id no.9～12任一所示的启动子表达磺胺甲恶唑降解途径的相关基因。

2.根据权利要求1所述的脱氮副球菌，其特征在于，所述磺胺甲恶唑降解途径的相关基因包括但不限于sada、sadb、sadc、ssue、rutf、coga、sutr、psuk中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的脱氮副球菌，其特征在于，所述sada基因具有seq id no.1所示的核苷酸序列；所述sadb基因具有seq id no.2所示的核苷酸序列；所述sadc基因具有seq id no.3所示的核苷酸序列；所述ssue基因具有seq id no.4所示的核苷酸序列；所述rutf基因具有seq id no.5所示的核苷酸序列；所述coga基因具有seq id no.6所示的核苷酸序列；所述sutr基因具有seq id no.7所示的核苷酸序列；所述psuk基因具有seq idno.8所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求2或3所述的脱氮副球菌，其特征在于，以pind4质粒为表达载体表达所述基因。

5.根据权利要求1～3任一所述的脱氮副球菌，其特征在于，以脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)dytn-1为宿主。

6.核苷酸序列如seq id no.9～12任一所示的启动子在促进脱氮副球菌中蛋白表达方面的应用。

7.含有权利要求1～5任一所述脱氮副球菌的微生物制剂。

8.权利要求1～4任一所述的脱氮副球菌在降解磺胺甲恶唑中的应用。

9.一种降解磺胺甲恶唑的方法，其特征在于，将权利要求1～5任一所述的脱氮副球菌在含磺胺甲恶唑的环境中培养。

10.权利要求1～5任一所述脱氮副球菌，或权利要求7所述的微生物制剂在降解磺胺类污染物中的应用。

技术总结
本发明公开了降解磺胺甲恶唑的脱氮副球菌及其应用，属于合成生物学领域。本发明运用基因工程手段，从脱氮副球菌启动子库扩增序列，以结合转移的方式使带有启动子的降解基因成功在脱氮副球菌中优化表达，获得了高降解磺胺甲恶唑的菌株，降解效率可达44％，为运用代谢工程技术提高磺胺甲恶唑降解的研究提供成功案例。

技术研发人员：邓禹,周胜虎,朱容容,李国辉,赵运英,毛银
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13