本发明涉及核酸分子，尤其是涉及一种外源dna修复模板的构建方法及其应用，具体涉及到一种基于rosa26位点构建含有不同基因序列的外源dna修复模板的方法。
背景技术：
：：1、dna修复的方法主要包括核苷酸切除修复、碱基切除修复、错配修复以及双链断裂修复四种。核苷酸切除修复(ner)，即通过切除大片段的dna损伤进行修复；碱基切除修复(ber)，可修复个别碱基损伤；错配修复(mmr)，可修复碱基的错配；双链断裂修复(dsbr)，包括非同源末端连接和同源重组两种机制，前者直接连接损伤的断端而不需要模板，后者需使用完整的姐妹染色单体作为修复模板进行修复。2、《identification and characterization of rabbit rosa26 for gene knock-in and stable reporter gene expression》公开以下技术方案：搜索到兔的rosa26基因，在rabbit locus 103345511(genbank:xr_515377.1)位点上选取设计了sgrna，并根据序列选取要用到的同源臂，找公司合成，购买含有angptl3基因的商业化质粒，后续经过转化，扩增，酶切，无缝克隆，构建含有angptl3基因序列的外源dna修复模板，但是上述构建方法得到的外源dna修复模板的部分非功能区有一些同义突变，扩增片段过大，且没有找到合适的酶切位点进行切割，因此，亟需一种准确率高且测序验证无误的外源dna修复模板的构建方法。技术实现思路1、本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于rosa26位点构建含有不同基因序列的外源dna修复模板的方法。2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：3、第一目的，本发明提供了一种基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法，包括以下步骤：4、1)构建重组质粒；5、2)将酶切线性化的重组质粒和酶切后的外源基因序列连接，构成中间体质粒，所述中间体质粒含有启动子、外源基因序列和ploya尾；6、3)将穿梭质粒、中间体质粒、与rosa位点相关的上、下游同源臂片段通过无缝克隆连接，获得外源dna修复模板。7、本发明将含有启动子、外源基因序列和ploya的中间体质粒、与rosa位点相关的上、下游同源臂片段通过无缝克隆连接并入一个新的载体中，构建重组载体，且设置了合适的酶切位点(cla i和xho i)，可线性化或者换成其他功能基因进行研究。8、本发明设计的基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法进行了扩增，酶切，无缝克隆构建包含不同外源基因片段，例如angptl3基因，提高了构建准确率并完成测序验证无误。9、作为本发明所述基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法的优选实施方式，所述外源基因序列包括angptl3基因序列、pcsk9基因序列或nlrp3基因序列中的一种；优选地，所述外源基因序列为angptl3基因序列。10、作为本发明所述基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法的优选实施方式，所述上、下游同源臂片段的大小为1000bp。11、由于本发明选择外源片段大，选择上、下游同源臂片段的大小为1000bp，以提高外源基因的敲入效率。12、作为本发明所述基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法的优选实施方式，所述上、下游同源臂片段的核苷酸序列分别如seq id no：3和seq id no：6所示。本发明的上、下游同源臂片段紧邻酶切位点上下游1000bp，cas9发挥剪切作用后1000bp的长度更有利于敲入的进行。13、作为本发明所述基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法的优选实施方式，所述上、下游同源臂片段分别来源于gz0038042-1质粒和gz0038042-2质粒。14、作为本发明所述基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法的优选实施方式，所述上游同源臂片段使用的扩增引物如seq id no：4～5所示；所述下游同源臂片段使用的扩增引物如seq id no：7～8所示。15、作为本发明所述基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法的优选实施方式，所述中间体质粒使用的扩增引物如seq id no：10～11所示。16、作为本发明所述基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法的优选实施方式，所述启动子包括组织特异性表达启动子、肝脏特异性表达启动子或巨噬细胞特异性表达启动子中的一种。17、作为本发明所述基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法的优选实施方式，所述穿梭质粒包括lv-pcdna3.1穿梭2质粒。18、第二目的，本发明提供了上述基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法制备得到的外源dna修复模板。19、本发明构建通过中间体质粒，所述中间体质粒含有启动子、外源基因序列和ploya，包含了外源基因序列(例如angptl3功能基因序列)，以及紧邻rosa26位点cas9蛋白切割处上下游各1000bp左右的同源臂序列，可用于与cas9核糖核蛋白共同显微注射，达到敲入的目的。20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：21、本发明提供了一种基于rosa26位点构建含有不同基因序列的外源dna修复模板的方法，本发明将含有启动子、外源基因序列和ploya的中间体质粒、与rosa位点相关的上、下游同源臂片段通过无缝克隆连接并入一个新的载体中，构建出重组质粒，且设置了合适的酶切位点，可线性化或者换成其他功能基因进行研究。本发明提供的方法进行了扩增，酶切，无缝克隆构建含有不同基因序列的外源dna修复模板，提高了构建准确率并完成测序验证无误。技术特征：1.一种基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法，其特征在于，包括以下步骤：2.如权利要求1所述的基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法，其特征在于，所述外源基因序列包括angptl3基因序列、pcsk9基因序列或nlrp3基因序列中的一种；优选地，所述外源基因序列为angptl3基因序列。3.如权利要求1所述的基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法，其特征在于，所述上、下游同源臂片段的大小为1000bp。4.如权利要求3所述的基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法，其特征在于，所述上、下游同源臂片段的核苷酸序列分别如seq id no：3和seq id no：6所示。5.如权利要求1所述的基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法，其特征在于，所述上、下游同源臂片段分别来源于gz0038042-1质粒和gz0038042-2质粒。6.如权利要求5所述的基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法，其特征在于，所述上游同源臂片段使用的扩增引物如seq id no：4～5所示；所述下游同源臂片段使用的扩增引物如seq id no：7～8所示。7.如权利要求1所述的基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法，其特征在于，所述中间体质粒使用的扩增引物如seq id no：10～11所示。8.如权利要求1所述的基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法，其特征在于，所述启动子包括组织特异性表达启动子、肝脏特异性表达启动子或巨噬细胞特异性表达启动子中的一种。9.如权利要求1所述的基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法，其特征在于，所述穿梭质粒包括lv-pcdna3.1穿梭2质粒。10.如权利要求1～9任一项所述的基于rosa26位点构建外源dna修复模板的方法制备得到的外源dna修复模板。技术总结本发明涉及核酸分子
技术领域：
：，具体公开了一种基于ROSA26位点构建外源DNA修复模板的方法，包括以下步骤：构建重组质粒；将酶切线性化的重组质粒和酶切后的外源基因序列连接，构成中间体质粒，所述中间体质粒含有启动子、外源基因序列和PloyA；将穿梭质粒、中间体质粒、与ROSA位点相关的上、下游同源臂片段通过无缝克隆连接，获得外源DNA修复模板。本发明将含有启动子、外源基因序列和PloyA的中间体质粒、与ROSA位点相关的上、下游同源臂片段通过无缝克隆连接并入载体中，构建出重组质粒，本发明提供的方法提高了构建准确率并完成测序验证无误。技术研发人员：陈亚檞,杨宇,张双,邹家伦,袭昊瞳,朱茂碧,范江霖受保护的技术使用者：五邑大学技术研发日：技术公布日：2024/1/13